تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال المناعة البشرية، مثل كيفية حدوث التواصل بين الكريات البيض على المستوى الجزيئي والخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل الخلايا التائية البشرية غير المُهَرَّرة في فترة زمنية قصيرة نسبياً. إثبات هذا الإجراء سيكون هينينغ كيرجسنر، وهو فني من مختبرنا.

تبدأ عن طريق خلط ملليلتر واحد من الدم المحيطي البشري رسمها حديثا مع 30 ملليلتر من ACK العازلة تحلل في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة، وملء أنبوب مع برنامج تلفزيوني لغسل الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في مليلتر اثنين من المتوسطة الثقافة لاحتضان 60 دقيقة في 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، إضافة خمس مرات 10 إلى الخامس المكورات العنقودية aureus enterotoxin B أو SEB محملة أو تفريغ خلايا راجي في 500 ميكرولترات من المتوسطة الثقافة في أنابيب FACS الفردية، تليها 650 ميكرولترات من الكريات البيض عموم.

تدور أسفل الثقافات المشتركة، وإعادة تثبيت الكريات في 150 ميكرولترات من الثقافة الطازجة المتوسطة لاحتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية. ثم، دوامة بلطف الخلايا لمدة 10 ثانية في 100 دورة في الدقيقة في حين إضافة 1.5 ملليلتر من 1.5٪ شبهformaldehyde. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ووقف التثبيت مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني تكملها 1٪ BSA وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

Resuspend الكريات في 100 ميكرولترers من برنامج تلفزيوني زائد BSA و 0.1 ٪ سابونين ، وإضافة عينات الخلية إلى اثنين من الآبار الفردية من 96 بئرا ، يو القاع لوحة. بعد 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي لوحة وإعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني زائد BSA والسابونين التي تحتوي على الأجسام المضادة الفلورو-مترافق أو المركبات ذات الاهتمام لاحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، وغسل الخلايا ثلاث مرات في 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني زائد BSA والسابونين وإعادة تعليق الكريات في 60 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.

لتصوير الخلايا بواسطة عملية تدفق الخلايا، افتح برنامج التحليل، تحقق من مستوى السائل، وانقر فوق بدء التشغيل في قائمة "الأداة". بعد ذلك، انقر فوق تحميل ثم قم بتحميل العينات في المنفذ عند المطالبة. ضمن علامة التبويب الإضاءة، قم بتغيير قوة الليزر الإثارة إلى أطوال نانومتر مناسبة.

ثم، ضبط البوابات للقنوات الرابعة و 11، وضبط المنطقة للقناة الأولى. لتقييم تعديلات الطاقة الغاتر والليزر، قم بالتبديل إلى القائمة عرض البوابة المعنية وضبط البوابات والقوى الليزر حتى الخلايا والأزواج الخلية مرئية. ثم، في علامة التبويب الحصول على الملفات، حدد اسم العينة وعدد الصور التي يجب الحصول عليها والبوابة المناسبة لتلوين CD3 وانقر فوق الحصول على لبدء عملية الاستحواذ.

لتحليل صور الخلايا التي تم الحصول عليها، افتح برنامج التحليل المناسب. اتباع التعليمات في القائمة المنسدلة التعويض، إنتاج مصفوفة التعويض وحفظ المصفوفة كما comp date ctm. بعد ذلك، افتح نموذج ملف الصورة الخام، وتطبيق ctm تاريخ شركات في الإطار لإنشاء صورة تعويضية وملفات تحليل البيانات الافتراضية.

بعد فتح ملفات الصور التعويضية، قم بتحويل الصور إلى وضع الألوان. ضبط جداول البحث للحصول على الألوان المرئية الأمثل في شريط أدوات خصائص معرض الصور. افتح "إدارة القناع" في القائمة "تحليل" ثم تعريف الخلايا T بتحديد قناع عتبة 60٪ للقناة خمسة وتعبئة القناع لإنشاء قناع الخلية T.

بعد ذلك، حدد قناع الوادي للقناة الثانية بعرض ثلاثة بكسل لإنشاء قناع الوادي، وقم بدمج الخلية T وأقنعة Valley لإنشاء قناع نقاط الاشتباك العصبي في الخلية T. لحساب التعبير CD3 الإجمالي في الخلايا T، افتح "إدارة الميزات" ثم قم بإنشاء ميزة Intensity، خلية T، قناة خمسة. لحساب المبلغ الإجمالي لـ F-actin في الخلايا التائية، قم بإنشاء ميزة Intensity، الخلايا التائية، القناة السادسة.

لتقييم كمية CD3 في نقاط الاشتباك العصبي المناعي، إنشاء كثافة ميزة، T الخلية المشبك، القناة الخامسة. لتحديد كمية F-actin في المشبك المناعي، إنشاء ميزة كثافة، T الخلية المشبك، القناة السادسة. وأخيراً، لتحديد إثراء F-actin و CD3، حساب نسب F-actin أو CD3 في المشبك المناعي والتعبير الكلي للبروتين المختار، على التوالي.

في هذه الرسوم البيانية، يتم عرض نظرة عامة على استراتيجية ال gating الحرجة لتحديد كمية الإثراء البروتيني في المشبك المناعي بين الخلايا البديلة التي تقدم المستضدات، أو APCs، والخلايا التائية في كريات الدم البيض عموم غير مطهرة مأخوذة من عينة دم بشرية منخفضة الحجم. هنا، يتم عرض صور تمثيلية من T-خلية-APC conjugates مع مستويات منخفضة من CD3 و F-actin داخل نقاط الاشتباك العصبي المناعي في غياب SEB، في حين أن هذه conjugates T-خلية-APC إظهار الإثراء CD3 و F-actin قوية في وجود SEB. في غياب superantigen، 15٪ من الخلايا التائية أظهرت إثراء كل من CD3 و F-actin في المشبك المناعي، في حين لوحظ 29٪ من الإثراء في وجود superantigen.

في الواقع، في غياب superantigen، أقل من 20٪ من مجموع F-actin في الخلايا يتراكم في المشبك المناعي، مع أكثر من 30٪ لوحظ في المشبك في وجود superantigen. وتجدر الإشارة إلى أن CD3 يتراكم في المشبك المناعي حتى في غياب superantigen، على الرغم من أن هذا التراكم أيضا زيادة كبيرة بإضافة superantigen، مما يدل على اللياقة البدنية لهذه الطريقة لتحديد كمي تراكم البروتين في المشبك المناعي خلية T-APC. وبمجرد أن يتقن، يمكن أن تكتمل هذه التقنية في ست إلى سبع ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تشمل جميع الضوابط ذات الصلة، بما في ذلك العينات دون superantigen، كما يحدث إثراء البروتين أيضا إذا تم استخدام APCs دون SEB. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر فائقة الدقة للإجابة على أسئلة إضافية حول البنية الدقيقة للمناوب المناعي. بعد تطورها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الاتصالات الخلوية لاستكشاف المشبك المناعي في البشر للأبحاث الأساسية والتجارب السريرية والعلوم الانتقالية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل منطقة الاتصال T-cell-APC والمشابك المناعي في الخلايا التائية الإنسان السابق. لا تنس أن العمل مع المواد البشرية الأولية يمكن أن تكون خطرة وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أو العمل في إطار مستوى السلامة البيولوجية شرطين ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.