استخدام الاشراط الكلاسيكي اييبلينك تتبع لتقييم هيبوكامبال الخلل في نموذج الفئران من اضطرابات طيف الكحول الجنيني

الهدف العام من هذه التجربة هو توضيح كيف يمكن أن يساعد استخدام التكييف الكلاسيكي لتتبع العين ، وهو شكل من أشكال التعلم الترابطي ، في اكتشاف الخلل الوظيفي في الحصين في نموذج الفئران لاضطرابات طيف الكحول الجنينية. تواجه صغار الفئران حديثي الولادة تحديا بجرعة عالية من الكحول ، بتركيز 11.9٪ من حجم الكحول في طريقة تشبه الشراهة. خلال ما يعادل الثلث الثالث من الحمل في البشر فيما يتعلق بنمو الدماغ.

يعد هذا النمط من التعرض للكحول والجرعة من العوامل الرئيسية في إنتاج عجز في الدماغ على مدى الحياة التي تحاكي الحالات البشرية لمرض FASD. الحصين هو منطقة الدماغ المهمة التي تتعرض للخطر بسبب التعرض المبكر للكحول. بعد أن تكبر الفئران كبالغين ، يتم فحصها بحثا عن خلل وظيفي في الحصين باستخدام التكييف الكلاسيكي الأثري.

هذا شكل من أشكال التعلم الترابطي عالي المستوى يعتمد على سلامة الحصين. خلال أيام ما بعد الولادة من أربعة إلى تسعة ، يتم وزن صغار الفئران كل صباح ويتم تسجيل أوزانها. ثم يتم الحصول على أحجام التغذية من طاولة مطبوعة مسبقا بناء على وزن الجسم.

يتم تسليم محلول كحول بحجم 11.9٪ إلى صغار الفئران على مدى وجبتين تفصل بينهما ساعتان. الجرعة اليومية الإجمالية من الكحول هي 5.25 جرام لكل كيلوغرام في اليوم. يوفر نموذج التعرض الشراهة هذا 0278 مل من الكحول لكل جرام من وزن الجسم لكل رضعة في محلول الحليب.

استخرج الحليب المحتوي على الكحول باستخدام حقنة معقمة سعة مليلتر واحد. ثم ادفع المحلول الزائد للحصول على الكمية المطلوبة بالضبط. اغمس طرف أنبوب PE-10 في زيت الذرة الطازج.

هذا يسهل الإدخال. قم بقياس طول أنبوب PE-10 من فم الجرو إلى معدته. إذا لزم الأمر ، اضبط سدادة PE-50 لتكون بمثابة دليل مرئي لنقطة التوقف.

أدخل أنبوب PE-10 بعناية في فم الجرو. ستواجه عادة بعض المقاومة عندما يلتقي الطرف بالحلق. قم بمناورة الأنبوب حتى ينحني الطرف في مدخل المريء.

حاول ألا تدع الأنبوب ينزلق للخلف ، لأنه قد يكون زلقا مع الزيت. استمر في أسفل المريء وعندما يمر الطرف بالعضلة العاصرة المعدية المريئية ، فإنه سيدخل معدته. توقف عند هذه النقطة ، وقم بتثبيت المضخة ، وقم بتسليم الحل.

يجب أن يتم ذلك بمعدل بطيء. قم بإزالة أنبوب PE-10 بعناية وافحص الجرو بحثا عن الغسيل العكسي للمحلول أو الدم أو الإصابة الجسدية. استبدل الجرو بزملائه في القمامة إذا كان الأمر جيدا.

راجع البروتوكول المكتوب وقائمة المواد للأدوات المحددة المستخدمة في إجراء جراحة الجفن. تعقيم المجال الجراحي بمطهر معتمد وتعقيم جميع الأدوات والمستلزمات الجراحية في وقت مبكر. بعد إحداث التخدير المناسب في الفئران مع الأيزوفلوران ، احلق رأسه باستخدام ماكينة تشذيب الفراء ، مما يكشف عن كمية كافية من الجلد لموقع الشق والجفن الأيسر.

يتم تعقيم جلدها عن طريق إجراء ثلاثة دعك بالتناوب التي تحتوي على 70٪ من كحول الأيزوبروبيل واليود البوفيدون. اتبع الإجراء القياسي في تأمين الفئران بالجهاز التجسيمي باستخدام قضبان الأذن. تابع الجراحة عندما يظهر الجرذ مستوى مخدر مناسب.

استخدم شفرة المشرط لعمل شق خلفي أمامي عند خط الوسط. يجب أن يكشف هذا الشق عن منطقة كافية أمام العينين وخلف خط حمض لامدا. استخدم شفرة المشرط لكشط السمحاق الموجود أعلى الجمجمة ، بحذر ، حتى لا تسبب نزيفا مفرطا.

امسح النسيج الضام الزائد والدم بقطعة قطن مقلوبة واشطف المنطقة بمحلول ملحي معقم بين الخدوش. حفر حفرة تبدأ مباشرة خلف الخيط الإكليلي على عظم جداري واحد. قم بإزالة أي بقايا دم وعظام باستخدام قطعة قطن ذات رؤوسة.

استخدم ملقط منظيا للإمساك بمسمار 0 80. استخدم مفك براغي لربط المسمار بالفتحة ، وشد المسمار بما يكفي دون الإضرار بأنسجة المخ القشرية ، وعادة ما تكون من ثلاث إلى أربع لفات كاملة. اتبع نفس الإجراء لتأمين البراغي المتبقية.

يجب أن يكون هناك براغي مثبتة بشكل ثنائي خلف الخيط الإكليلي وواحد على العظم الجداري الأيمن ، أمام خياطة لامدا. أمسك الجلد العلوي في موقع شق العين اليسرى باستخدام ملقط الضمادات بأربع بوصات ووجه ملقط الضمادات بطول ثلاثة بوصات نحو زاوية هذه العين. خذ إبرة واحدة مقاس 26 بوصة 3/8 بوصة وأدخلها من خلال زاوية الجفن.

قم بتدوير الإبرة بحيث يكون الجانب المشطوف متجها لأعلى. أدخل الإبرة الثانية في منتصف الجفن. استخدم ملقطا دقيقا للإمساك بسلك 3T وإدخاله في إحدى الإبر.

لا تحتاج إلى إدخاله بالكامل. اتبع نفس الإجراء لسلك 3T الثاني. أمسك كلتا الإبرتين بيد واحدة مع الإمساك بمرحلة الرأس باليد الأخرى.

في حركة واحدة مستمرة ، اسحب الإبر بعيدا عن الجفن أثناء توجيه مرحلة الرأس في نفس الاتجاه. أثناء الإمساك بمرحلة رأس مخطط كهربية العضل بيد واحدة ، استخدم ملقط الضمادة بحجم ثلاثة بوصات باليد الأخرى للف سلك 10T حول أحد البراغي أو كليهما على الجانب الأيمن. قم بإزالة هذا السلك حتى لا يبرز من البراغي.

يجب توسيط مرحلة رأس مخطط كهربية العضل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. استخدم ملقط الضمادة بحجم أربعة بوصات لإنشاء جيب صغير عن طريق فصل الجلد ، أي اللفافة السطحية عن العضلة الصدغية. مع إنشاء الجيب ، استخدم مقص القزحية لقطع المزيد من الأنسجة الضامة ، والعمل في زاوية العين اليسرى.

احرص على عدم التعمق أو قطع أي أوعية دموية. خذ قطبا كهربائيا ثنائي القطب وشكل سلك السلك بحيث يمكن تركيبه على طول انحناء العضلة الصدغية. سيتم وضع الشكين خلف العين اليسرى وسيتم وضع الطرف السفلي من القطب ثنائي القطب مباشرة فوق الجمجمة.

امزج مسحوق Ortho Jet في المكونات السائلة للحصول على قوام سائل. ضع المعجون بملعقة صغيرة في جميع أنحاء موقع الشق. احرص على عدم إسقاط أي معجون على عيون الفئران واحتفظ بها.

اسمح ل Ortho Jet بالوصول إلى حالة شبه جافة ، ثم استخدم ملقط الشظية لإزالة الأكريليك الزائد على مرحلة رأس EMG. وخيوط القطب ثنائي القطب. قم بقص سلك 3T الزائد ، مع ترك بضعة سنتيمترات للعمل معها.

قم بإزالة درع PTFE بعناية من كل سلك 3T باستخدام ملقط التشريح الدقيق. هذا يسمح لهم بالاتصال بالعضلة العينية الدائرية. استخدم ملقط التشريح الدقيق لإنشاء خطافات على كل طرف من أسلاك 3T.

قم بقص السلك الزائد ، مع الحرص على عدم قطع الكثير بحيث يتراجع السلك المتبقي مرة أخرى إلى الجفن. الكابلات مصنوعة في المنزل. يتم توصيل القابس الأبيض ثنائي القطب أولا ، وهذا يسمح بتوصيل الحافز الأمريكي الصادم.

يتم توصيل قابس مرحلة الرأس EMG البرتقالي بعد ذلك. يسجل النشاط العضلي الكهربائي بينما يومض الفئران. يؤدي كلا المقابس إلى مبدل دائري في الجزء العلوي من الذراع يحافظ على استمرارية الإشارة بينما يتحرك الجرذ بحرية.

يتم تشغيل عازل التحفيز وإجراء فحوصات نهائية للأجهزة. يتضمن ذلك ضبط خط الأساس لمخطط كهربية العضل إلى مستوى يمكن عرضه على شاشة الكمبيوتر. في الجلسة الأولى ، يتم ضبط شدة الصدمة أولا على 4 مللي أمبير وسيتم زيادتها في وحدات 4 مل أمبير كل تجربتين.

تسمح هذه المراحل في الإجراء للفئران بالتأقلم مع محفز الصدمة. بحلول التجربة الثامنة ، يتم الحفاظ على شدة الصدمة عند 1.6 ملي أمبير طوال هذه الجلسة وجميع الجلسات اللاحقة. يقوم جهاز كمبيوتر منفصل بتشغيل راسم الذبذبات الرقمي رباعي القنوات والذي يسمح لنا بإجراء تشخيص الإشارات في الوقت الفعلي.

لاحظ وميض العين الذي انبعث منه الجرذ في المربع الأول. يشير راسم الذبذبات أيضا إلى أن إشارة EMG الأساسية نظيفة نسبيا مع ضوضاء منخفضة. تسمح لنا كاميرات الويب بمراقبة كل فأر أيضا.

هذه لقطة شاشة من الإصدار 4.0 من برنامج blink تظهر فترة تجريبية تستمر 1400 مللي ثانية. في أول 280 مللي ثانية ، لا يتم تقديم أي محفزات للحصول على مقياس لنشاط مخطط كهربية العضل الأساسي. يشير الخط الأصفر إلى خط العتبة الذي تكون فيه أي استجابة مخطط كهربية العضل تتجاوز 4 فولت فوق متوسط قيمة خط الأساس قبل CS مؤهلة كاستجابة وميض.

يتم تسليم محفز حالة النغمة البالغ 85 ديسيبل عند نقطة زمنية 280 مللي ثانية. تظل النغمة قيد التشغيل لمدة 380 مللي ثانية وهو ما يتوافق مع النقطة الزمنية البالغة 660 مللي ثانية. بعد إيقاف تشغيله ، هناك فاصل زمني قدره 500 مللي ثانية حيث لا يتم تقديم محفزات وهذا ما يسمى بفترة التتبع حيث يجب على الجرذ حل إزاحة النغمة CS مع بداية الصدمة US ، والتي لا يزال يتعين تسليمها عند علامة 1160 مللي ثانية.

تستمر صدمة الولايات المتحدة لمدة 100 مللي ثانية. بطبيعة الحال ، تثير الصدمة في الولايات المتحدة استجابة وميض دفاعية تعرف باسم الاستجابة غير المشروطة ، أو UR التي يتم قياسها في نافذة زمنية تبلغ 140 مللي ثانية. تتكون دورة التدريب الواحدة من 100 تجربة.

هناك 90 تجربة يتم فيها إقران CS و US وفي كل تجربة عاشرة ، يتم تسليم CS فقط. هناك 10 تجارب CS فقط لكل جلسة. تسمح لنا هذه التجارب بالتحقيق فيما إذا كانت تعلم جمعية CS الأمريكية أم لا.

في شكل استجابات للحالة ، أو يتم التعبير عن CR عندما لا تكون الصدمة US موجودة. ويقدر متوسط الفاصل الزمني بين المحاكمات ب 30 ثانية، بحيث لا يمكن التنبؤ ببدء كل تجربة. في أي تجربة معينة ، قد يرمش الجرذ في أي وقت وسيتم تسجيل مخطط كهربية العضل الخاص به بواسطة البرنامج.

سيتم اعتبار أي وميض عين سري يتجاوز خط العتبة استجابة في واحدة من أربع فئات بناء على وقت حدوثها وفترة التجربة. إذا يومض الجرذ خلال أول 80 مللي ثانية بعد ظهور النغمة CS ، فإن الاستجابة تعتبر استجابة مذهلة أو SR. هذه استجابة غير ترابطية تدل على الأداء الحركي الحسي ، ولكنها لا تتعلم جمعية CS الأمريكية في حد ذاتها. إذا يومض بعد فترة SR ولكن قبل تسليم الصدمة الأمريكية ، فقد أصدرت استجابة مشروطة.

كما ذكرنا سابقا ، فإن السجل التجاري هو المقياس الأساسي للتعلم الترابطي. لا يتوقع أن يتطور CR خلال المراحل الأولى من التدريب ، ولكن مع تقدم التدريب عبر العديد من التجارب والجلسات ، تصبح هذه الأنواع من الاستجابات أكثر تواترا ، وأعلى في السعة ، وقد تكون أكثر توقيتها. نقوم بتقسيم CRs إلى نوعين ، إجمالي CRs و CRs التكيفية.

يعكس إجمالي CRs القدرة العامة على التعلم بينما تعكس Crs التكيفية قدرة على توقيت وميضه جيدا. مباشرة قبل ظهور الصدمة ، كطريقة لتستعد نفسها ، تكون فترة CR التكيفية 200 مللي ثانية قبل ظهور الصدمة في الولايات المتحدة. في الثدييات ذات الحصين السليم ، يعكس التعبير عن CRs التكيفية مشاركة الحصين عالية المستوى في توقيت الوميض بشكل صحيح فيما يتعلق بتوصيل المحفزات.

بطبيعته ، فإن التكييف الكلاسيكي لتتبع وميض العين أصعب بكثير من تأخير التكييف الكلاسيكي حيث تتداخل نغمة CS والصدمة الأمريكية في الوقت المناسب. في حين أن التعبير عن CRs قد يختلف من موضوع إلى آخر ويمكن أن يتأثر بشدة بالتحديات التي تواجه دوائر الدماغ السرية ، فمن المتوقع أن ينبعث UR خلال كل تجربة مزدوجة CS US. على هذا النحو ، يعكس هذا المقياس الأداء الحركي الحسي ومثل الاستجابات المذهلة ، لا يدل على تعلم جمعية CS US في حد ذاتها.

في السلسلة التالية من مقاطع الفيديو ، سترى إعداد البرنامج وبدء تدريب الوميض. يتم تنشيط برنامج الوميض ويتم تجنيد الملفين المناسبين. ملف فئران يحتوي على بيانات الموضوع ، وملف تكييف وميض العين المتتبع.

يتم إعداد البرنامج حتى يبدأ التدريب. عند بدء التدريب ، لاحظ أن هناك مؤقتا في الجزء السفلي الأيمن من الشاشة يقوم بالعد التنازلي للإصدار التجريبي التالي. فيما يلي تسجيل فيديو مباشر للجلسة الأولى ، التجربة 15 ، حيث ينبعث UR ولكن لم يتم تطوير CRs حتى الآن.

هنا إعادة بثلث السرعة. في السلسلة التالية من المقاطع ، سترى لقطات شاشة من نفس فأر التحكم غير التنبيب أثناء تقدمه خلال ست جلسات من التدريب. ينبعث منه في النهاية كلا من إجمالي CRs و CRs التكيفية.

إليكم مقطع فيديو مباشر للجلسة السادسة ، التجربة 96 ، حيث تنبعث ومضتان ، أحدهما CR تكيفي ، والآخر UR. هنا إعادة بثلث السرعة. في هذا المقطع الأخير ، سترى مقطع فيديو مباشرا لفأر تنبيب بالكحول في تجربته الأخيرة من الجلسة السادسة ، وهي تجربة CS فقط ، حتى بعد 600 تجربة تدريب ، فإنها لا تنبعث منها CR تكيفي بشكل موثوق. بعد جمع البيانات ، يتم فحصها بحثا عن تجارب سيئة ، تتكون من قطع أثرية عالية الضوضاء ، ونشاط غير عادي لمخطط كهربية العضل الأساسي قبل CS باستخدام خوارزمية خطأ مدمجة للكشف عن القيم المتطرفة.

يتم تحليل التجارب الجيدة التي يتم الاحتفاظ بها بشكل أكبر من أجل SRs و URs و إجمالي CRs و CRs التكيفية فيما يتعلق بالنسبة المئوية للاستجابات والسعة والكمون والمقاييس الهامة الأخرى. يظهر متوسط CRs التكيفية عبر ست جلسات من التدريب في هذه المجموعة الأولى من النتائج. كانت كل من مقاييس النسبة المئوية والسعة ذات دلالة إحصائية بين المجموعة المنبوبة بالكحول والمجموعتين الضابطتين من الجلسة الثانية حتى الجلسة السادسة.

يشير هذا إلى أن تواتر وقوة CRs التكيفية قد ضعفا في الفئران المعرضة للكحول أثناء التطور المبكر. يظهر متوسط الاستجابات غير المشروطة في هذه المجموعة الثانية من النتائج. لم يكن كل من مقاييس التردد والسعة مختلفين إحصائيا بين أي من المجموعات.

تشير هذه النتائج إلى أن التعرض المبكر للكحول لم يضعف قدرة الفئران على الرمش إلى المنبه غير المشروط ، ولكن الضعف الذي أظهروه كان بسبب الفشل في ربط CS و US بشكل صحيح أثناء الاستحواذ. في هذه التجربة ، قمنا بفحص علاقة سلوك الدماغ من خلال تحديد ما إذا كان التعرض للكحول التنموي الذي يتم تسليمه في طريقة الشراهة يؤثر على الحصين كما ينعكس في العجز وتتبع التكييف الكلاسيكي في غمضة العين. في الواقع ، يعد التكييف الكلاسيكي في رمشة العين أداة مفيدة لتقييم العواقب السلوكية العصبية المرتبطة بالتعرض للكحول أثناء نمو الدماغ.

إنه متعدد الاستخدامات للغاية من حيث أنه من خلال تغيير معلمات التحفيز أو متطلبات التعلم الترابطي ، يمكن أيضا تقييم السلامة الوظيفية لأنظمة الدماغ المختلفة خارج الحصين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للتعقيدات التي ينطوي عليها توصيل الكحول إلى صغار الفئران حديثي الولادة ، وزرع الأقطاب الكهربائية ، وإجراء إجراء اختبار رمش العين. نشكرك على مشاهدة هذا الفيديو.