للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

الهدف العام من هذه التجربة الموائع الدقيقة هو قياس ترسب الصفائح الدموية في وقت واحد في تكوين الفيبرين على سطح تفاعلي في ظل ظروف التدفق باستخدام الفحص المجهري بالفيديو في الوقت الفعلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال طب نقل الدم حول تأثيرات تحضير تركيز الصفائح الدموية على طبيعة التخثر للدم المنقول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسهل التحليل المتزامن لوظيفة الصفائح الدموية والتخثر في التدفق ، مما يسمح بفحص التفاعل بين كلتا العمليتين.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتخثر الصفائح الدموية الناجم عن مسار التلامس ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة المسار الخارجي عن طريق الطلاء بعامل الأنسجة الدهنية. ستظهر الإجراء روزالي ديفلو ، فنية من المختبر. ابدأ إعداد غرفة تدفق الموائع الدقيقة عن طريق سحب 0.8 ميكرولتر من الكولاجين المعاد تكوينه حديثا إلى خمسة أسداس طول كل قناة على أحد طرفي رقاقة حيوية جديدة يمكن التخلص منها مع ثماني قنوات متوازية مستقيمة ووضع علامة على هذه النهاية من الرقاقة الدقيقة على أنها المخرج.

احتضان الرقاقة الحيوية عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل في حاوية رطبة ومحكمة الغلق. في نهاية الحضانة ، املأ القنوات المشفرة بعدد متساو من القنوات على شكل حرف Y في رقاقة حيوية للخلط مع مخزن مؤقت حظر. أعد الرقاقة إلى الحاوية لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، ضع دبوسا في أحد طرفي اثنين وثمانية سنتيمترات وقطعة واحدة بطول سنتيمترين من الأنابيب وفي كلا طرفي قطعة واحدة بطول 46 سم من الأنابيب لكل قناة قيد الاستخدام. بعد ذلك ، استخدم برنامج Nanopump لشطف جميع سوائل المضخة في الأنبوب المتصل بالماء المقطر وحقنة في دبوس موصل الحقنة لملء جميع الأنابيب الأخرى بمخزن مؤقت منع. بعد ذلك ، قم بتثبيت الرقاقة الحيوية المشفرة على مرحلة المجهر الآلي باستخدام مقبس مقص المختبر لإصلاح الرقاقة الحيوية للخلط على نفس ارتفاع مرحلة المجهر.

استخدم المسامير الموجودة في الأنابيب التي يبلغ طولها ثمانية سنتيمترات لتثبيت هذه القطع من الأنابيب في مدخل الرقاقة الحيوية للخلط ووضع الطرف الحر لكل أنبوب في قارورة من محلول ملحي HEPES. الآن ، قم بتوصيل الرقاقة الحيوية المشفرة بالرقاقة الحيوية للخلط بقطعة الأنبوب التي يبلغ طولها 46 سم في خط مرن ولكن مستقيم. قم بتوصيل دبوس موصل حقنة بالأنبوب المتوافق مع اللور لمضخة الشطف.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الدبوس بالطرف الحر لقطعة الأنبوب التي يبلغ طولها سنتيمترين وقم بتثبيت الطرف الآخر من الأنبوب بمخرج الرقاقة الحيوية المشفرة. ثم اشطف جميع الأنابيب والقنوات بملليلتر واحد من HBS. لتحضير مضخات التروية ، افتح برنامج Microfluidic Perfusion Pump Driver وانقر نقرا مزدوجا على أيقونة المحاقن لتهيئة المضخات.

حدد نوع المحقنة التي سيتم استخدامها وافصل مضخة الشطف والأنبوب المتصل بها بطول سنتيمترين. قم بتوصيل الأنبوب المنفصل بحجم سنتيمترين بدبوس موصل المحقنة بقفل اللور لقطعة من أنابيب النفايات ذات الجدران السميكة واستخدم حقنة لملء الأنابيب ذات الجدران السميكة بمحلول البيبسين القياسي. بعد ذلك ، قم بتأمين الطرف المفتوح للأنبوب ذو الجدران السميكة بمشبك Kocher.

قم بتثبيت الأنبوب بمخرج الرقاقة الحيوية المشفرة. افصل الأنبوبين من غرفة تدفق الخلط معا وتخلص من حاويات HBS. بعد الحصول على عينة الدم في حاويات سترات الصوديوم المفرغة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب ونقل البلازما الغنية بالصفائح الدموية إلى أنبوب طرد مركزي جديد.

قم بتدوير الحاويات بالبلازما الغنية بالصفائح الدموية مرة أخرى. بعد ذلك ، انقل البلازما الطافية الفقيرة بالصفائح الدموية إلى أنبوب طرد مركزي مختلف. بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 21 لتثقيب قاع حاويات سترات الصوديوم للسماح لخلايا الدم الحمراء المعبأة بالتنقيط في أنبوب مخروطي جديد.

عندما يتم جمع جميع خلايا الدم الحمراء المعبأة ، أعد تكوين الدم برفق عن طريق الجمع بين خلايا الدم الحمراء المعبأة المنفصلة والبلازما الفقيرة بالصفائح الدموية وإضافة الصفائح الدموية المعدة لنقل الدم للحصول على عينات بنسبة 40٪ هيماتوكريت و 2.5 مرة 10 إلى الصفائح الدموية الخامسة لكل تركيز ميكرولتر إلى حجم نهائي 2.5 مليلتر والحصول على تعداد دم كامل. بعد ذلك ، أضف 13 ميكرولترا من الفيبرينوجين المسمى بالفلوروفور إلى أنبوب مخروطي البوليسترين. متبوعا بملليلتر واحد من الدم المعاد تكوينه.

امزج ملليلترا آخر من الدم مع ميكرولترين من صبغة الصفائح الدموية الفلورية وأضف عينات الدم الملصقة معا. بعد ذلك ، اقلب عينات الدم المختلطة برفق واحتضان الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. قبل البدء في فحص التروية ، ركز بصريات المجهر على ألياف الكولاجين الملتصقة بأسفل القناة الأولى.

باستخدام برنامج الاستحواذ ، حدد منطقة الاهتمام في القناة المحددة. قم بتحميل مليلتر واحد من مخزن التخثر المخزن المؤقت المسخن مسبقا في حقنة سعة مليلتر واحد وقم بتركيب المحقنة على مضخة التروية. بعد انعكاس لطيف ثان ، قم بتحميل الدم في حقنة سعة ملليلترين وقم بتركيب المحقنة على مضخة التروية.

بعد ذلك ، استخدم دبوس موصل حقنة لتوصيل كلتا المحاقن بقطعة واحدة من الأنابيب التي يبلغ طولها ثمانية سنتيمترات وتجهيز الموصلات والأنابيب بسرعة 400 ميكرولتر في الدقيقة. عندما تمتلئ كل الأنابيب إما بمخزن مؤقت للتخثر أو الدم ، قم بتثبيت الطرف الآخر من كلا الأنبوبين على الأرجل المنقسمة للقناة على شكل حرف Y في الرقاقة الحيوية للخلط. بعد ذلك ، قم بإزالة مشبك Kocher عند مخرج أنبوب النفايات وابدأ التروية بمعدل 4.4 ميكرولتر في الدقيقة لمخزن التخثر و 44 ميكرولتر في الدقيقة للدم المعاد تكوينه.

سجل الصور كل 10 ثوان لمدة 30 دقيقة في الوقت الفعلي ، وقم بإنهاء المضخات والحصول على الصور بعد 30 دقيقة أو عندما تصبح الإشارة مشبعة. بعد ذلك ، تخلص من جميع الأنابيب والمحاقن كنفايات خطرة بيولوجيا. يقدم هذا الفيديو مثالا ممتازا على تراكم الجلطات الصفائحية وترسب الفيبرين.

في بداية التروية ، التصقت الصفائح الدموية بالسطح التفاعلي ، مما أدى إلى زيادة مطردة في التألق الأخضر المسجل. خلال مرحلة الالتصاق هذه ، هناك القليل من التألق البنفسجي الذي يشير إلى أن الفيبرين يتكون بشكل هامشي فقط. عند بدء التخثر ، يترسب الفيبرين الفلوري العنيف بسرعة مع تراكم التألق الأخضر للصفائح الدموية بنفس المعدل تقريبا.

لذلك يمكن استقراء لحظة بداية التخثر كمحدد لإمكانات التخثر للصفائح الدموية. لا تؤثر إضافة مثبط التربسين للذرة إلى الدم المعاد تكوينه على التصاق الصفائح الدموية ولكن التخثر لا يبدأ طوال المدة الإجمالية لتجربة التروية. من خلال زيادة عدد الصفائح الدموية في عينة معاد تكوينها ، يزداد معدل الالتصاق والتراكم والتخثر خطيا.

يتم تقصير لحظة البداية بشكل كبير عن طريق زيادة تركيز الصفائح الدموية ، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى عدد عتبة من الصفائح الدموية المترسبة المنشطة لتحفيز التخثر. علاوة على ذلك ، في التحليل المزدوج للقنوات المغلفة بالكولاجين فقط ، أو بالاشتراك مع عامل الأنسجة الدهنية المؤتلف ، تكون بداية التخثر أسرع بكثير ، على الرغم من عدم اختلاف المعدل الإجمالي للتخثر ولا تراكم الصفائح الدموية بين الظروف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تجربة غرفة تدفق الموائع الدقيقة مع دم معاد تكوينه مزدوج التسمية للتحليل المتزامن لوظيفة الصفائح الدموية والتخثر.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال طب نقل الدم لاستكشاف التفاعلات بين الصفائح الدموية والتخثر تحت التدفق. في هذا الفيديو ، ركزنا على إظهار تجربة موحدة. ولكن يمكن إدخال تغييرات في طلاء السطح أو ضغوط الدرع أو تركيز الكالسيوم للإجابة على أسئلة بحثية محددة ذات أهمية.