عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم
يوليو 18, 2017
نحن تصف إنشاء الأورام القولون والمستقيم مثلي عن طريق حقن الخلايا السرطانية أو أورغانويدس في الأعور من الفئران والعزلة اللاحقة من الخلايا السرطانية المتداولة (كتس) من هذا النموذج.
الهدف العام من هذه التقنية المجهرية هو حقن خلايا ورم القولون والمستقيم في جدار الأعور للحث على أورام القولون والمستقيم القابلة للتكاثر والنقيلية في الفئران. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلايا السرطانية المنتشرة ، ومزاياها الرئيسية هي الأورام الموحدة والتكاثر بدرجة كبيرة ، مما يسمح بالتنبؤ بالمرحلة الموثوق به والتنبؤ بالخلايا السرطانية المنتشرة. ابدأ باستخدام ملقط غير رضحي لإخراج أعور فأر يعاني من نقص المناعة يبلغ من العمر ستة إلى ثمانية أسابيع بعناية.
وضع الطرف الأعمى من الأعور على البطن بحيث يشير الكيس إلى الجمجمة. للحقن داخل الرأس ، قم بتركيب حقنة قياسية سعة مليلتر واحد مزودة بكانيلا قياس 30 وقم بتحميلها بالخلايا السرطانية على مضخة حقن دقيقة مثبتة على مناور دقيق. بعد ذلك ، استخدم الملقط اللارضحي للإمساك بعناية بطرف الأعور واستخدم ملقطا ثانيا مبلل بمحلول ملحي دافئ لتنعيم الأعور برفق بضربات هبوطية.
الآن حرك تحت مجهر جراحي مجهر ومع وجود الكانيلا موازية مباشرة للأعور وفوقها ، استخدم ملقطين غير رضحيين لتمديد الأنسجة بعناية في طرفي الطرف الخارجي من الأعور. اسحب الأعور ببطء فوق الكانيلا ، مع الحرص على عدم ثقب حزام الجدار بالكامل أو المصل إلى ما بعد نقطة الاختراق الأولية ووضع الكانيلا فوق الأوعية الدموية وتحت الغشاء الشفاف الرقيق داخل حزام الجدار. عندما تكون الكانيلا في مكانها ، استخدم مفتاح القدم لحقن 20 ميكرولترا من الخلايا على مدى 20 ثانية.
بين بطانة المصل الرقيقة الشفافة ، فوق الأوعية الدموية داخل الجدارية والعضلات. عندما يتم حقن جميع الخلايا ، قم بإزالة الكانيلا بعناية وضع مقايضة جافة تحت الأعور. لمنع انتشار البريتونية الاصطناعية ، قم بتحليل أي خلايا مسربة بشطف الماء المقطر جيدا وأعد الأعور برفق إلى تجويف البطن.
أغلق جدار البطن بخيوط جري سريعة الامتصاص ، في الجلد بمشابك جراحية للجرح. ثم ضع الماوس على حصيرة تسخين مضبوطة على 38 درجة مئوية مع المراقبة حتى الاستلقاء الكامل. لعزل الخلايا السرطانية المنتشرة ، عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة ، املأ 15 مليلتر أنابيب مخروطية بخمسة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة لكل أنبوب وانقل عينات الدم الكاملة التي تم جمعها بعناية من الحاملة للورم إلى طبقات تدرج الكثافة.
افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، واسترجع بعناية الواجهة التي تحتوي على الخلايا أحادية النواة. ماصة الخلايا أحادية النواة في أنبوب جديد سعة 15 ملليلتر لطرد مركزي ثان. تليها غسلات الأنبوب في PBS.
بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS ، مكملة ب EDTA وأضف أربعة ميكرولترات من الجسم المضاد للمعسكر المضاد إلى كل عينة ، لمدة 20 دقيقة حضانة على الجليد في الظلام. بعد ذلك ، استخدم قلم حاجز كاره للماء لرسم دائرة بطول سنتيمترا واحدا تقريبا في طبق بتري معقم يبلغ طوله ستة سنتيمترات لكل عينة وإضافة 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت للقطف إلى كل دائرة ، متبوعا ب 50 ميكرولترا من تعليق الخلية. استخدم مجهرا للتحقق من كثافة الخلايا ، واترك العينات تستقر لمدة خمس دقائق تقريبا.
ثم قم بفحص قطرة الخلايا من أجل إيجابية معسكر أمبير واستخدم المعالج الدقيق لنقل الخلايا ذات الأهمية إلى 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت المناسب لتحليل المصب اللاحق المقصود. يؤدي استخدام خلايا القولون والمستقيم في هذا النموذج بشكل موثوق إلى المزيد من الفئران الوفيرة في غضون 35 يوما من حقن الخلايا السرطانية ، مع حجم الأورام الأولية حوالي 10 ملليمترات ، ومع ورم خبيث في الكبد والرئة ، والخلايا السرطانية المنتشرة ، موجودة دائما تقريبا. علاوة على ذلك ، يمكن عزل الخلايا السرطانية المنتشرة بسهولة لتحليلها في اتجاه مجرى النهر.
بمجرد إتقانها وإذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون 10 دقائق ، مما يسهل تكوين أورام موحدة ونقيلية يمكن استخدامها في الدراسات العلاجية والجزيئية. تشمل قيود النموذج ، اعتماده على ليز الخلية ، والتي لها حدودها الخاصة ، بالإضافة إلى نقص المناعة لدى الفئران ، وكلاهما يمكن التغلب عليه باستخدام خلايا سرطان القولون والمستقيم الطافرة. نظرا لبساطته ، قد يكون هذا النموذج إضافة قيمة للنماذج المتاحة حاليا لسرطان القولون والمستقيم.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة تقنية جراحية مجهرية لإنشاء أورام قولونية مستقيمة في موقعها الأصلي لدى الفئران عن طريق حقن الخلايا الورمية في الأعور. تسمح هذه الطريقة بعزل الخلايا الورمية المتداولة (CTCs) وتوفر نموذجاً قابلاً للتكرار لدراسة سرطان القولون والمستقيم النقيلي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأورام
- علوم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تلعب الخلايا الورمية المتداولة (CTCs) دوراً محورياً في عملية الانتقال السرطاني.
- يعد إنشاء نموذج موثوق لدراسة الخلايا الورمية المتداولة (CTCs) أمراً أساسياً في أبحاث السرطان.
- تهدف هذه التقنية إلى إنشاء أورام متجانسة لتحقيق نتائج تجريبية أفضل.
- يسمح استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة بدراسة الخلايا الورمية البشرية.
الغرض من الدراسة
- لتطوير نموذج قابل للتكرار لسرطان القولون والمستقيم في الفئران.
- لتسهيل دراسة الخلايا الورمية الجوالة وبيولوجيتها.
- لتحسين فهم تطور الورم وانتقاله.
الطرق المستخدمة
- حقن الخلايا الورمية في جدار الأعور لدى الفئران.
- استخدام ملاقط غير صدمية للتعامل بحذر مع الأعور.
- استخدام مضخة حقن دقيقة للتوصيل الدقيق للخلايا الورمية.
- مراقبة تطور الورم وعزل الخلايا الورمية المتداولة (CTC) بعد الحقن.
النتائج الرئيسية
- التأسيس الناجح لأورام القولون والمستقيم في الموقع الأصلي لدى الفئران.
- عزل الخلايا الورمية المتداولة من الأورام التي تم تأسيسها.
- إثبات قابلية تكرار نموذج الورم.
- إمكانية التنبؤ الموثوق بمرحلة الورم وسلوك الخلايا الورمية المتداولة (CTC).
الاستنتاجات
- توفر تقنية الجراحة المجهرية أداة قيمة لأبحاث سرطان القولون والمستقيم.
- يمكن لهذا النموذج أن يعزز فهم بيولوجيا الخلايا الورمية المتداولة (CTC).
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه الطريقة لتطوير العلاجات.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يعد إنشاء نماذج أورام في موضعها الأصلي قابلة للتكرار أمراً بالغ الأهمية لتقليل المخاطر عند التحقق من صحة الأهداف وتحسين الثقة التنبؤية في تطوير أدوية سرطان القولون والمستقيم. تتيح هذه التقنية الجراحية المجهرية عزلاً موثوقاً للخلايا الورمية الدوارة (CTCs)، مما يدعم الدراسات الميكانيكية لعمليات الانتقال والاستجابة العلاجية. ويعالج هذا النموذج فجوة انتقالية رئيسية من خلال توفير نظام ذي صلة بالمرض لتقييم بيولوجيا الورم والفعالية العلاجية في الجسم الحي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح اختبار الفرضيات العلاجية من خلال تكوين أورام منتظمة وإطلاق متسق للخلايا الورامية المنتشرة (CTC).
- القيمة التشغيلية: يوفر نظاماً معيارياً للتحقق الوظيفي من الأهداف باستخدام الأورام الأولية، أو الخطوط الخلوية ثنائية الأبعاد (2D)، أو العضويات ثلاثية الأبعاد (3D).
- القيمة التنبؤية: يدعم فرز مجموعة المشاريع العلاجية عن طريق ربط نمو الورم بالإمكانات النقيلية والكشف عن الخلايا الورامية المنتشرة (CTC).
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج نماذج حاملة للأورام مناسبة لسير عمل عزل وتحليل الخلايا السرطانية الدوارة (CTC).
- القابلية للتكرار: توفر أوراماً موحدة وإنتاجية متسقة من الخلايا السرطانية الدوارة (CTC)، مما يتيح ظروفاً موثوقة لفحص المركبات.
- القابلية للتوسع: تسهل تحضير أنظمة بيولوجية معتمدة للمقاييس عالية الإنتاجية القائمة على الخلايا السرطانية الدوارة (CTC).
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: ينمذج تطور سرطان القولون والمستقيم البشري، بما في ذلك النقائل الكبدية والرئوية، داخل مضيف يعاني من نقص المناعة.
- الاستمرارية الترجمية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال تمكين عزل الخلايا الورامية الدوارة (CTC) لدراسات المؤشرات الحيوية والديناميكا الدوائية.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: يدعم معايير المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) بناءً على عبء النقائل وديناميكيات الخلايا الورامية الدوارة (CTC) الملاحظة داخل الجسم الحي.
تكامل مسارات العمل وسير العمليات
تتكامل هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف، بدءاً من التحقق الأولي من الهدف، مروراً بتحديد المركبات الرائدة، وصولاً إلى اختبارات الفعالية قبل السريرية، لا سيما في البرامج التي تركز على النقائل السرطانية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمحركات النقيلة وتعديل المسارات من خلال ضمان استزراع الأورام وتوليد الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) بشكل ثابت.
- الفحص: تتيح توحيد المقايسات من خلال عزل موثوق للخلايا السرطانية المتداولة (CTC)، مما يدعم القراءات الكمية لتقييم المركبات.
- التحليلات: توفر مقاييس لإنتاجية ونقاء الخلايا السرطانية المتداولة (CTC) مما يساعد في مقارنة الظروف العلاجية وآلية العمل.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال السماح بالمراقبة الطولية للخلايا السرطانية المتداولة (CTC) كعلامة بيولوجية للديناميكا الدوائية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لمنصة في الموقع الأصلي (orthotopic) قابلة لإعادة الاستخدام والتكيف عبر أهداف سرطان القولون والمستقيم والأنماط العلاجية المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية في نماذج الانتقال السرطاني وتقلل من الغموض الآلي في بيولوجيا الخلايا الورمية المتداولة (CTC).
- القيمة التشغيلية: توفر نماذج أورام قياسية وقابلة للتكرار مع مخرجات كمية من الخلايا الورمية المتداولة (CTC).
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المتابعة أو الإيقاف من خلال ربط العبء الورمي بديناميكيات الخلايا الورمية المتداولة (CTC)، مما يقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- التأثير على محفظة المشاريع: تتيح تحديد أولويات المرشحين بناءً على تعديل المخاطر وفقاً لتثبيط الانتقال السرطاني وتصفية الخلايا الورمية المتداولة (CTC).
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الجراحة المجهرية في الحقن في الموقع الأصلي والتعامل مع الأنسجة.
- يعتمد على مضخات الحقن المجهري، والمناورات، والمجاهر الجراحية لضمان دقة التوصيل.
- يستلزم وجود بروتوكولات موحدة لتحضير الخلايا الورمية من مصادر ثنائية الأبعاد (2D)، أو ثلاثية الأبعاد (3D)، أو مصادر أولية.
- يتطلب بنية تحتية لعزل الخلايا الورمية المتداولة (CTC)، بما في ذلك الطرد المركزي بتدرج الكثافة والاختيار القائم على الأجسام المضادة.
- محدود بالاعتماد على مضيفين مثبطي المناعة، مما قد يؤثر على الدراسات العلاجية المتعلقة بالمناعة.
