أورجانوتيبيك شريحة هيبوكامبال الثقافات كنموذج للدراسة نيوروبروتيكتيون واختزاع الخلايا السرطانية

التحضير والتقطيع باستخدام جهاز الفايبراتوم (vibratome). يلزم توفير ثلاث كتل من الآجار لتثبيت الدماغ أثناء عملية التقطيع. ولتجنب التلوث، استخدم مجموعة أدوات معقمة بجهاز الأوتوكلاف (Autoclave).

قم بإزالة الآجار. يجب تجفيفه على ورق ترشيح قبل لصقه على الصفيحة المعدنية باستخدام غراء Cyanoacrylate الطبي. وباستخدام ملعقة مختبر (spatula)، قم بإزالة الدماغ ووضعه بعناية في طبق بتري مملوء بوسط التحضير.

بعد ذلك، جفف الدماغ سريعاً باستخدام ورق الترشيح. غطِّ الصفيحة المعدنية بغراء السيانوأكريلات (Cyanoacrylate) الطبي. استخدم الملقط والمكشطة لوضع الدماغ على حامل العينة.

استخدم قطعتي الآجار اللتين تم تحضيرهما مسبقاً لضمان الاستقرار الميكانيكي من كلا الجانبين. وفي هذه المرحلة، يجب وضع الدماغ بجانب كتلة الآجار وتثبيته بكتلتين إضافيتين لمنع التلف أثناء عملية التقطيع. ضع الصفيحة المعدنية في جهاز التقطيع الاهتزازي (vibratome) وقم بتغطية النسيج بوسط تحضير بارد.

بعد ذلك، قم بتشريح النسيج أفقيًا بسمك 350 micrometers في محلول OHSC باستخدام المقطاع الاهتزازي المنزلق (sliding vibratome). انقل الشرائح إلى طبق بتري، باستخدام ظهر ماصة باستور مكسورة لجمع الشرائح. احتفظ بشرائح الدماغ في وسط تحضير بارد.

قم بتقييم الشرائح بصرياً باستخدام مجهر ثنائي العينين. افصل منطقة الحصين وادخل إلى القشرة الداخلية باستخدام مشرط ذو شفرة مستديرة مقاس 15. من المهم أخذ الشرائح ذات البنية الخلوية السليمة فقط والمعزولة من الجزء الأوسط للحصين بين الحصين الظهري والحصين البطني.

يجب التخلص من الخلايا الجذعية المكونة للهيموغلوبين (OHSCs) ذات الجودة المنخفضة فوراً. يتم نقل شريحتين إلى ثلاث شرائح من الشرائح التي تم الحصول عليها إلى غرسة زراعة الخلايا ذات حجم مسام يبلغ 0.4 micrometer. يتم سحب وسط التحضير من أعلى غرسة زراعة الخلايا باستخدام ماصة باستور.

ضع الغرسة في طبق زراعة بستة آبار يحتوي كل بئر منها على 1 mm من وسط الزراعة. حضّن أطباق الآبار الستة عند 35 °C في جو رطب تماماً مع 5% CO2، وقم بتغيير وسط زراعة الخلايا كل يومين. بعد ستة أيام من الزراعة لأنسجة الجرذان، أو 14 يوماً لأنسجة الفئران، تكون التفاعلات الالتهابية المرتبطة بإجراء التقطيع نفسه قد اختفت.

يمكن الآن إجراء التجارب. نتائج نموذجية لدراسات الحماية العصبية. يوضح الجزء (أ) من الصورة شرائح OHSC غير مصابة تم الاحتفاظ بها في وسط زراعي لمدة تسعة أيام في المختبر دون أي علاج، لتعمل كشرائح ضابطة.

كما تم التأكيد بواسطة المجهر المسحي الليزري البؤري، أظهرت مجموعة التحكم (OHSC) حفظاً جيداً للخلايا العصبية. وقد توزعت الخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ Isolectin B4 بشكل أساسي في الطبقتين الجزيئية والشبكية، وأظهرت نمطاً ظاهرياً متفرعاً. وفي طبقة الخلايا الحبيبية للتلفيف المسنن، وُجد عدد قليل جداً من الخلايا الدبقية الصغيرة الموجبة لـ Isolectin B4، ولم يتم العثور تقريباً على أي نوى موجبة لـ Propidium Iodide.

وُضعت مجموعة أخرى من خلايا OHSC، كما هو موضح في الجزء B من الصورة، في وسط استزراع لمدة ستة أيام، ثم أحدثت فيها إصابة باستخدام NMDA بتركيز 50 ميكرومولار لمدة أربع ساعات، ثم أُبقيت في وسط الاستزراع لمدة ثلاثة أيام أخرى. وبعد الإصابة بـ NMDA، حدث تراكم هائل للخلايا الدبقية الصغيرة المنشطة والموجبة لـ Isolectin B4 والتي التصقت بموقع الإصابة العصبية عبر جميع طبقات التلفيف المسنن.

كشف التحليل الكمي أنه في الطبقة الحبيبية للتلفيف المسنن، كان عدد الخلايا الدبقية الصغيرة الإيجابية لـ Isolectin B4 أعلى في OHSC المصابة مقارنة بظروف التحكم. وبطريقة مماثلة، زاد عدد العصبونات المتنكسة الإيجابية لـ Propidium Iodide بشكل ملحوظ في الطبقة الحبيبية للشرائح المصابة بـ NMDA. نتائج عينية لدراسات غزو الورم.

تُظهر جميع الصور نتائج غزو الورم SS باستخدام OHSC والتي تم تصويرها بواسطة مجهر المسح الليزري البؤري. يشير اللون الأحمر إلى البنية الخلوية لـ OHSC واللون الأخضر إلى الخلايا الورمية. تُظهر الصورة A نمط غزو نموذجي لخلايا الورم الأرومي الدبقي U138 التي تُرِكت لتغزو لمدة أربعة أيام.

يمكن ملاحظة أورام كروية واضحة ومتميزة، ويبدو هيكل OHSC سليمًا مع ظهور واضح للتلفيف المسنن والقرن الأموني. وتظهر الصورة B نمط غزو مختلفًا، نتج عن خلايا الورم الأرومي الدبقي LN229 بعد أربعة أيام. وفي هذه الحالة، لا يمكن تمييز الأورام الفردية بوضوح بسبب الشبكة المتكونة التي تغطي معظم OHSC، رغم أن البنية الخلوية تظل سليمة مع بقاء التلفيف المسنن والقرن الأموني دون تشوه.

ويمكن استنتاج أن خلايا LN229 أكثر غزوًا من خلايا U138. وتُظهر الصورتان C وD نتيجة غزو الورم ذاتها لخلايا LN229 بعد أربعة أيام من الغزو. ويمكن ملاحظة أن الكتلة الورمية تغطي كامل مجال الرؤية تقريبًا في الجانب الأيسر.

تظهر الصورة D صبغ يوديد البروبيديوم المقابل. في هذه الشريحة، لم تعد البنية الخلوية سليمة، حيث لم يعد قرن آمون مرئيًا، كما أن التلفيف المسنن مشوه أيضًا. قد يكون السبب المحتمل لهذه النتيجة هو أن الـ OHSC لم يكن سليمًا تمامًا في بداية تلك التجربة، أو استخدام عدد كبير جدًا من الخلايا الورمية، أو طول فترة الغزو بشكل زائد مما أدى إلى فقدان البنية الملحوظ.

وبناءً على ذلك، يجب استبعاد هذا النوع من نتائج الغزو. تمثل مستنبتات شرائح الحصين ذات التنظيم العضوي نموذجاً مخبرياً (in vitro) ممتازاً يعكس فيزيولوجيا الدماغ مع الحفاظ على الروابط العصبية سليمة. وباعتبارها نموذجاً واحداً، يمكن الحصول على عدة مستنبتات من الشرائح، مما يسمح باختبار ظروف متعددة في أنسجة مستمدة من حيوان واحد، كما أن النتائج تكون عالية التكرارية.

نظراً لدرجة الوصول العالية، تعد مزارع شرائح الحصين ذات النمط العضوي ملائمة تماماً للعديد من الأنواع التجريبية. ويشمل ذلك دراسات الفسيولوجيا الكهربائية وتكون الخلايا العصبية، بالإضافة إلى تجارب الحماية العصبية، وغزو الأورام، وتفاعلات الخلايا الورمية مع أنسجة الدماغ السليمة.