سينوكلينس α β و γ المؤتلف تحفيز البروتين الفوسفاتيز 2A نشاط الحفاز وحدة فرعية في فحوصات الخلية الحرة

تعمل بروتينات synucleins ألفا وبيتا وجاما المؤتلفة على تحفيز نشاط الوحدة الفرعية التحفيزية لإنزيم البروتين فوسفاتاز 2A في المقايسات الخالية من الخلايا. مرحباً، اسمي سوفاناراك ليك، وأنا طالب طب في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس تيك، إل باسو، كلية بول ل. فوستر للطب.

سأقوم في هذا الفيديو باستعراض مقايسة قياس الألوان ثنائية الاتجاه لبروتين الفوسفاتاز باستخدام بروتينات السينوكلين المؤتلفة. تحضير المحاليل المنظمة والكواشف. تحضير محلول p-Nitrophenol Phosphate المنظم.

لتحضير 50 mils من محلول pNPP المنظم، قم بإذابة Trizma base في 25 mils من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء في دورق. أضف قضيب تحريك نظيفاً وضعه على جهاز تحريك مغناطيسي. وبمجرد ذوبان Trizma، أضف كلوريد الكالسيوم مع الاستمرار في التحريك.

اضبط قيمة pH لتصل إلى 7.0. انقل المحلول إلى مخبار مدرج. أكمل الحجم النهائي الإجمالي إلى 50 mils باستخدام ماء منزوع الأيونات فائق النقاء.

تحضير محلول الأخضر الملاكيتي. يتطلب محلول الأخضر الملاكيتي ثلاثة محاليل، الأجزاء A وB وC. المحلول A هو حمض الهيدروكلوريك بتركيز 4 molar. أما المحلول B فهو مزيج من موليبدات الأمونيوم بالإضافة إلى المحلول A. والمحلول C هو ملح أوكسالات الأخضر الملاكيتي بتركيز 0.045%.

لتحضير المحلول D، اخلط جزءاً واحداً من B مع ثلاثة أجزاء من C، بنسبة 1 إلى 3. حرك المزيج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، قم بترشيح المحلول D عبر غشاء مسامي بقطر 22 micrums واحفظه عند درجة حرارة 4 °C.

يُحفظ بعيداً عن الضوء. تحضير المنشط. المنشط عبارة عن محلول Tween 20 بتركيز 1%.

قم بنقل 10 µL من Tween 20 إلى 990 µL من الماء منزوع الأيونات شديد النقاء باستخدام الماصة. اخلط المزيج بجهاز Vortex حتى يذوب Tween 20 تماماً. تحضير المحلول العامل من الأخضر المالاكيت مع Tween 20.

أضف المنشط إلى المحلول D بنسبة 1 إلى 100. تحضير فسفو ببتيد الثريونين. لتحضير محلول مخزون pT بتركيز 2 mM، أضف 550 microliters من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء إلى 1 milligram من pT.

قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس حتى يذوب الببتيد الفوسفوري تماماً. يوضع على الثلج للاستخدام الفوري. تُحفظ حصص pT الإضافية في درجة حرارة -20 درجة مئوية.

تحضير السينوكلين. أعد تعليق 1 mg من السينوكلين في 1 mL من الماء منزوع الأيونات فائق النقاء بتركيز نهائي قدره 1 mg/mL. استخدم جهاز الرج المداري (Vortex) بلطف للإذابة.

استخدم المحلول فوراً وقم بتخزين الحصص غير المستخدمة عند درجة حرارة -80 °C. تحضير معايير الفوسفات. الخطوة الأولى من تحضير معايير الفوسفات.

لتحضير محلول فوسفات مخزني بتركيز 1 mM، أذب فوسفات البوتاسيوم في ماء منزوع الأيونات فائق النقاء في دورق يحتوي على قضيب تحريك. انقل المحلول إلى مخبار مدرج وأكمل الحجم النهائي إلى 100 mils. هذا المحلول بتركيز 10 mM.

قم بترشيح المحلول بالكامل عبر مرشح 22 micros باستخدام حقنة كبيرة. خفف هذا المحلول بنسبة 1 إلى 100 لتحضير محلول فوسفات بتركيز 1 mM لاستخدامه كمعايير للمقايسة. الخطوة الثانية من معايير الفوسفات.

أضف الكمية المناسبة من الفوسفات بالإضافة إلى الماء منزوع الأيونات عالي النقاوة إلى أنابيب سعة 1.5 مل وفقاً للجدول. سينتج عن ذلك أنابيب تحتوي على 150، و 300، و 600، و 1,200، و 2,400 pmol من الفوسفات. ثم تُخزن الحصص في درجة حرارة 20- درجة مئوية.

مقايسة نشاط PP2A. قم بتحضير مقايسة PP2A في أنابيب سعة 1.5 مل على الثلج. أضف 43 µL من منظم pNPP.

أضف 1 µL من PP2Ac البشري المؤتلف. أضف السينوكلين (synuclein) ثم قم بحضن PP2A مع السينوكلين لمدة 30 دقيقة على جهاز Nutator عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، أضف 16 µL من pT بتركيز 2 mM.

يُحضن المزيج لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية في حمام مائي. وفي طبق 96 بئرًا ذي قاع مسطح، تُضاف 25 µL من كل معيار فوسفات في مكررات ثنائية، بترتيب تصاعدي من التركيز المنخفض إلى العالي. ثم تُنقل 24 µL من كل مقايسة PP2A في مكررات ثنائية إلى نفس طبق الـ 96 بئرًا الذي يحتوي على المعايير.

قم بماصة 75 microliters من المحلول D الذي يحتوي على Tween 20 لكل عينة ومعيار. عند إضافة MGT، ستلاحظ تغيراً في اللون في الآبار عند وجود الفوسفات الحر. التحليل الفوتومتري.

قم بالتحليل باستخدام مقياس الطيف الضوئي المضبوط على 630 nanometers. نتائج ممثلة. لدينا هنا مقايسة PP2A ممثلة والرسم البياني الذي يوضح منحنى القياس المعياري.

تظهر على اليسار معايير الفوسفات، حيث تزداد درجة اللون الأخضر قتامةً كلما زاد تركيز الفوسفات في الآبار. وعلى اليمين، يوجد PP2A الذي تم تحضينه مع alpha أو beta أو gamma synucleins بتركيزات مولارية مختلفة.

كانت التركيزات الأعلى أكثر فعالية في تحفيز نشاط الوحدة الفرعية الحفازة لـ PP2A. نرى هنا التمثيل البياني لنشاط PP2A استجابةً لتركيزات متفاوتة من alpha synuclein وbeta synuclein وgamma synuclein. وقد كانت جميعها، alpha synuclein وbeta synuclein وgamma synuclein، محفزات كبيرة لنشاط PP2A عند تركيز يتراوح من 1 إلى 2 micromolar.

كان كل من ألفا سينوكلين وبيتا سينوكلين فقط محفزات ذات دلالة لنشاط PP2A عند تركيز 0.5 micromolar. يوضح الشكل ثلاثة تفاعل PP2Ac مع السينوكلينات الداخلية في دماغ الفأر. في A، تظهر بروتينات ألفا وبيتا وغاما سينوكلين المؤتلفة كضوابط إيجابية.

في B، تم إجراء الترسيب المناعي المشترك باستخدام الجسم المضاد 1D6 النوعي لـ PP2Ac، والذي أدى إلى ترسيب PP2Ac وكذلك ترسيب كمية كبيرة من alpha synuclein المتفاعل، ولكن لم يتم ترسيب beta synuclein تقريبًا. كما لم يترسب gamma synuclein مع PP2Ac في الترسيب المناعي المشترك. تشير بيانات الترسيب المناعي المشترك هذه إلى أن alpha synuclein هو المعدل الداخلي لـ PP2Ac في الجسم الحي.

نود أن نشكر كل من ساعدنا في إعداد هذا الفيديو. وفي الختام، معكم روث بيريز وسونافاراك ليك.

خافيير فارغاس. أتمنى لكم نجاحاً باهراً. وداعاً وبالتوفيق.