عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة

الهدف العام لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة المغناطيسية CD11b هو تحقيق عائد نهائي عالي النقاء من الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الولادة في فترة زمنية قصيرة نسبيا لأغراض التجارب متعددة الاستخدامات في المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل آليات الإشارات ذات الصلة بالالتهاب العصبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق المتاحة حاليا هي أن العزل يستغرق حوالي 30 دقيقة ، دون أي تضحيات في النقاء أو المحصول أو الجدوى.

ابدأ بنقل الرؤوس المقطوعة حديثا من صغار الفأر البالغة من العمر يوما إلى يومين إلى غطاء تدفق الهواء الرقائقي. بعد ذلك ، استخدم مقصا مستقيما مقاس 4.5 بوصة لعمل شق صغير في الجمجمة والسحايا عن طريق إدخال الأطراف في الفتحة التي شكلها قطع الرأس وقطع الذيلية إلى المنضدة. بعد إجراء الشق ، قشر أحد نصف الكرة الأرضية إلى الجانب.

ثم استخدم زوجا من الملقط المنحني أو المعقوف لإزالة الدماغ بالكامل. انقل الدماغ إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على ملليلترين من 0.25٪ تريبسين EDTA ، واحتضانه لمدة 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. اغسل الدماغ بوسط نمو جديد عن طريق إضافة الوسط وإزالته.

بعد الانتهاء من الغسيل ، أضف ملليلترين من وسط النمو لكل دماغ ، وقم بتجانسها عن طريق تجربة الدماغ. عندما لا تصبح أنسجة المخ أصغر ، انتقل إلى ماصة ذات فتحة أصغر. في نهاية التجربة ، عندما يكون التعليق واضحا بدون قطع مرئية ، قم بتمرير التعليق عبر مصفاة خلية 70 ميكرون لإنشاء ثقافة خلية واحدة.

ثم ضع الماصة من ثمانية إلى تسعة ملليلتر من وسط النمو في قوارير T75 ، وقارورتين لكل دماغ ، وأضف مليلتر من تجانس الدماغ إلى كل قارورة. تنمو الخلايا حتى العزلة في اليوم السادس عشر. بعد ستة عشر يوما ، انقل وسط النمو من القارورة إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.

أضف ثلاثة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى كل قارورة T75. ثم رج القوارير لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. جهاز الطرد المركزي وسط النمو عند 0.4 مرات جم لمدة خمس دقائق.

بعد الاهتزاز لمدة خمس دقائق ، أضف ما لا يقل عن أربعة ملليلتر من وسط الثقافة بالطرد المركزي لإيقاف تفاعل التربسين EDTA ، وقم بترتيورته للتأكد من فصل جميع الخلايا. ثم مرر الخلايا عبر مصفاة خلية 70 ميكرومولار لإنشاء ثقافة خلية واحدة. قم بإجراء تعداد الخلايا ، ثم قم بالدوران عند 0.4 مرة جم لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك ، خذ أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر ، وأضف ملليلترا واحدا من الوسط الموصى به ، وقم بتمييز الغضروف المفصلي. أضف الوسيط الموصى به حتى 2.5 مل ، وقم بتمييز هذا الغضروف المفصلي أيضا. ثم, قم بإزالة الوسيط, وأعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من الوسط الموصى به.

انقل هذا المزيج إلى أنبوب بوليسترين سعة خمسة ملليلتر ، ثم خففه إلى علامة مليلتر واحد. ثم أضف 50 ميكرولترا من مصل الفئران لكل مليلتر واحد من الخلايا العالقة ، واحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة ، قم بإعداد كوكتيل الاختيار عن طريق خلط 25 ميكرولترا من المكون A و 25 ميكرولترا من المكون B ، بمجرد انقضاء الدقائق الخمس ، أضف 50 ميكرولترا من كوكتيل الاختيار إلى الخلايا ، واحتضن لمدة خمس دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.

دوامة الكريات المجهرية لمدة 45 ثانية. ثم أضف 80 ميكرولترا من الكريات المجهرية لكل مليلتر واحد من العينة ، واحتضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف الوسيط الموصى به حتى علامة 2.5 مل على أنبوب البوليسترين.

ضع الأنبوب في الحامل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اسكب الوسط ببطء في أنبوب بوليسترين سعة 15 مليلتر لا يزال في المغناطيس. كرر الفصل المغناطيسي ثلاث مرات أخرى ، في كل مرة أضف الوسط الموصى به حتى علامة 2.5 ملليلتر.

بعد الفصل المغناطيسي الأخير ، أضف ثلاثة ملليلتر من وسط النمو ، واحسب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلايا. ضع الخلايا في ألواح مطلية ب poly-D-lysine للعلاجات. قم بلوحة الجزء السالب من الأنبوب سعة 15 مليلتر ، والذي يحتوي في الغالب على الخلايا النجمية ، في قوارير T75.

بعد ست ساعات على الأقل من الحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية ، استبدل كل وسط النمو في القوارير التي تحتوي على الكسر السالب قبل العودة إلى الحاضنة. تظهر هذه الصورة الكيمياء الخلوية المناعية لمزرعة الخلايا الدبقية الدقيقة المعزولة التي تم فحصها من أجل IBA ، وهي علامة على الخلايا الدبقية الصغيرة في القناة الخضراء ، و GFAP ، وهي علامة على الخلايا النجمية ، في القناة الحمراء. يكشف تلطيخ Hoechst عن وجود نوى الخلية.

عدم وجود خلايا إيجابية ل GFAP أن الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام مجموعة الاختيار الإيجابية CD11b ، تتمتع أيضا بنقاء عالي. تم فحص هذه البروتينات المناعية من مزرعة الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من أجل GFAP ، والذي يظهر على شكل نطاق يبلغ حوالي 51 كيلودالتون ، و IBA1 ، والذي يظهر كنطاق يبلغ حوالي 15 كيلودالتون. تم استخدام بيتا أكتين كعنصر تحكم في التحميل ويظهر عند حوالي 42 كيلودالتون.

مشكلة مجموعة العزل القديمة هي أنه يمكن ملاحظة مضان البولي إيثيلين في القناة الحمراء كما هو موضح هنا. لا ينتج عن الإجراء المعدل أي مضان تلقائي من الخرز المغناطيسي ، كما هو موضح في القناة الحمراء هنا. يمكن استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة باستخدام هذا الإجراء لدراسات الإشارات.

يظهر تحليل اللطخة الغربية أنه يمكن اكتشاف Fyn و phospho-src tyrosine Y416 من الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بطريقتنا المكررة حديثا. يحتوي الجزء السالب من فصل الخلايا الدبقية الصغيرة على خلايا نجمية يمكن استخدامها لدراسات الإشارات. يظهر النشاف الغربي أن الجزء السالب يحتوي على خلايا موجبة GFAP.

يظهر تحليل اللطخة الغربية أنه يمكن اكتشاف Fyn و phospho-src tyrosine Y416 من الخلايا الإيجابية ل GFAP. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل الفحص المجهري الفلوري متعدد القنوات ، والنشاف الغربي ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، للإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني وإشارات البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية العزل السريع هذه لأغراض تجارب الخلايا الدبقية الدقيقة.