جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

الهدف العام من هذا البروتوكول لإنتاج عضويات دماغية بشرية مشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) هو نمذجة الاضطرابات العصبية التطورية البشرية المبكرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تطور الدماغ البشري، مثل دور الجسيمات التركيبية (synthesomes) والأهداب في تكوين الخلايا العصبية الجديد وصغر الرأس الأولي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها نموذجاً قوياً وسريعاً للحصول على نتائج قابلة للتكرار من العضويات الدماغية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات الخاصة بالمرضى.

سوف تقوم بتوضيح الإجراء Elke Gabriel، وهي باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري في مركز الطب الجزيئي في كولونيا. لبدء هذا الإجراء، اجمع الكرات العصبية باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 µL مع استخدام طرف مقاس 2 mm تم قصه مسبقاً بمقصات معقمة. بعد ذلك، ضع الكرات العصبية على فيلم بارافين في طبق سعة 100 mL بحيث تفصل بين كل كرة وأخرى مسافة 5 mL تقريباً.

قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط المتبقي بعناية. بعد ذلك، أضف قطرة من مصفوفة EHS على كل كرة عصبية مفردة. قم بتحضين قطرات مصفوفة EHS مع الكرات العصبية لمدة 15 دقيقة عند 37 degrees celsius.

بعد ذلك، اغسل الكرات العصبية بعناية من غشاء البارافين عن طريق شطفها بوسط زراعة الكرات العصبية. لاحقاً، قم بتحضين الكرات العصبية لمدة الأيام الأربعة التالية، وأضف 2 ملليلتر من وسط زراعة الكرات العصبية الطازج في اليوم الثاني. في هذا الإجراء، أضف 100 ملليلتر من وسط زراعة العضوانيات الدماغية إلى كل دورق دوار عبر أذرعه الجانبية.

وقُم بتدفئة الوسط مسبقاً في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، تأكد من أن جميع الكرات العصبية (neurospheres) منفصلة. وفي حال كانت كرتان أو أكثر متصلتين عبر مصفوفة EHS، فافصل بينها عن طريق قطع المصفوفة الرابطة باستخدام المشرط.

قم بضبط برنامج التقليب على 25 RPM. انقل بعناية الكرات العصبية المدمجة في مصفوفة EHS إلى قوارير التقليب (spinner flasks) التي تحتوي على 100 milliliters من وسط نمو العضوانيات (organoid medium). بعد ذلك، وزع قوارير التقليب على منصة تقليب مغناطيسية داخل الحاضنة لمدة 14 يوماً عند 37 degrees celsius.

هذا هو اليوم صفر من زراعة العضوانيات. يتم تغيير الوسط مرة واحدة في الأسبوع عن طريق إزالة نصف الوسط وإضافة الكمية نفسها من وسط جديد. في هذه الخطوة، يتم جمع العضوانيات من زراعة دورق الدوران (spinner flask) في اليوم 14 باستخدام ماصة ميكروية سعة 1 mL مقطوعة مسبقاً.

ضعها جميعاً في طبق قطر 60 مليمتر واغسلها مرة واحدة باستخدام 5 مليلتر من DMEM F12 الدافئ لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك، جهّز أنبوباً سعة 1.5 مليلتر يحتوي على 500 ميكرولتر من 4% PFA الدافئ. ضع كل عضواني بشكل منفصل في كل أنبوب وثبّتها لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، استخدم عروة تلقيح لإزالة العضوانيات. ثم قم بإزالة PFA واغسل العضوانيات المثبتة مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام 1 ml من PBS. لاحقاً، تُخزن العضوانيات في 1 ml من PBS عند 4 °C لمدة تصل إلى 7 أيام لاستخدامها لاحقاً.

لتضمين العضوانيات من أجل القطع بالتجميد، قم بإزالة PBS وإضافة 1 milliliter من محلول السكروز بتركيز 30% في كل أنبوب لتجفيف العضوانيات قبل تجميدها. بعد إضافة محلول السكروز، يجب أن تطفو العضوانيات على السطح. تُحفظ العضوانيات طوال الليل في محلول السكروز عند درجة حرارة أربع درجات celsius.

بحلول اليوم التالي، يجب أن تكون العضوانيات قد ترسبت في قاع الأنبوب. بعد ذلك، املأ قالباً عيّنياً من الفينيل بـ 400 milliliters من مركب OCT. واستخدم حلقة تلقيح لوضع عضوانية واحدة في مركز القالب.

ضع ملصقاً على حافة القالب يحتوي على اسم العينة. ثم قم بتجميد القالب الذي يحتوي على العضواني عند درجة حرارة -80 °C حتى يحين وقت القطع بالتجميد. بعد ذلك، قم بطلاء شرائح الزجاج المخصصة للقطع بالتجميد بـ 0.1% PLL و PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، اترك الشرائح لتجف لمدة ثلاث ساعات. تُحفظ الشرائح عند درجة حرارة 4 °C وتُسخن لتصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. عقب ذلك، يتم تقطيع العضوانيات المجمدة بالتبريد إلى شرائح يتراوح سمكها بين 20 إلى 50 µm على شرائح زجاجية مبردة مغطاة بـ PLL.

اترك المقاطع تجف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم خزن المقاطع عند درجة حرارة 80- Celsius حتى يتم إجراء المزيد من المعالجة. التصوير المناعي الفلوري للعضيّات المقطعة بالتجميد والتي تظهر منطقة VZ نموذجية والصفيحة القشرية البدائية. وتمتد منطقة VZ من الجانب القمي إلى الجانب القاعدي.

لاحظ أن الخلايا الموجودة داخل المنطقة البطينية (VZ) تظهر نوى تشبه السياج، مما يشير إلى أنها خلايا دبقية شعاعية. يوضح اللوح الأيمن صبغ الفلورة المناعية للخلايا السلفية العصبية (NPCs) الموجبة والمتموضعة داخل المنطقة البطينية والعصبونات الموجبة لـ TUJ1 في الصفيحة القشرية البدائية. معروض هنا مثالان للمناطق البطينية المصبوغة بـ PVIM و ARL 13B.

المناطق المحددة بمربعات بيضاء مكبرة. الخلايا الدبقية الشعاعية القمية التي تنقسم عند الجانب القمي من الـ VZ تكون موجبة لـ PVIM. مستوى انقسام خلية في طور الصعود يكون أفقياً بالنسبة لخط سطح التجويف الذي يتم تحديده بصبغة ARL 13B.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون 23 يوماً إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر إجراء فحص دوري للجودة وفحص الميكروبلازما للمزارع الخلوية. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التطور في البيولوجيا العصبية لاستكشاف آليات التطور العصبي في العضوانيات الدماغية البشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد عضوانيات دماغ بشرية من خطوط خلايا iPSC متنوعة، بما في ذلك خطوط خلايا المرضى التي تعاني من قصور في الوظائف الخلوية.