نضوج الجذعية البشرية العضلية المشتقة من الخلايا في Biowires باستخدام التنبيه الكهربائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام طرق زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الخاضعة للرقابة في التحفيز الكهربائي لتعزيز نضوج الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا القلبية متعددة القدرات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة أنسجة القلب بما في ذلك كيفية تأثير معلمات التحفيز الكهربائي المختلفة أو طول الوقت على وظيفة خلايا القلب وحالة النضج. النتائج النهائية هي أنسجة القلب البشري المصممة هندسيا لتحسين النضج.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تطبيقات التشخيص مثل اختبار سلامة وفعالية الأدوية الجديدة لأن خلايا عضلة القلب ذات الخصائص الناضجة مثل التقدم الكهربائي من المرجح أن تكون بمثابة نماذج أكثر دقة لخلايا القلب البشرية في دراسات فحص الأدوية. امزج مونومر PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 واخلطيهم جيدا. اتركه لمدة خمس دقائق حتى يتخلص من الغاز.

ثم قم بتحميل طبق بتري يحتوي على ماستر قالب السلك الحيوي بخليط PDMS. حاول تقليل تكوين فقاعة الهواء. بعد ذلك ، عالج PDMS عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.

ثم استرجع القالب المتصلب أولا باستخدام شفرة حادة حول الحواف ثم تقشيرها بعيدا. ثم قم بقص PDMS الزائد واجمع كل القوالب في كيس التعقيم. قم بتثبيت القوالب تلقائيا بالبخار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

ثم قم بتحميل كل قالب في طبق بتري معقم تحت تهوية خزانة السلامة الحيوية. الآن لكل قالب ، استخدم الملقط لتركيب قطعة من خياطة الحرير المعقمة 6.0 في الأخدود الذي يمتد على القناة بأكملها. ثم تكون القوالب جاهزة لتلقيح الخلايا.

ستكون الخيط بمثابة قالب لتشكيل تركيبات ثلاثية الأبعاد تتماشى على طول محور الخياطة التي تحاكي شكل ألياف القلب. لكل غرفة ، قم بعمل زوج من قطع البولي كربونات المستطيلة لتكون بمثابة إطار لغرفة التحفيز الكهربائي. على طول الخط المركزي لكل قطعة ، قم بحفر فتحتين بعرض ثلاثة ملليمترات ، على بعد سنتيمترين.

لكل غرفة قم بإعداد قضيبين من الكربون بطول 1.5 سم. حوالي 3 ملليمترات من نهاية كل قضيب حفر حفرة بعرض ملليمتر واحد. ثم قم بربط كل ثقب بسلك بلاتيني ولف أحد طرفي السلك حول القضيب.

بعد ذلك ، لكل غرفة ، أدخل قضيبين بين قطعتين من البولي كربونات لعمل إطار. ثم صب حوالي ملليلترين من PDMS في بئر من ستة ألواح جيدة وضع الإطار في البئر مع PDMS ، وغمر الجزء السفلي من الإطارات. عالج PDMS عند 70 درجة مئوية لمدة ساعتين حتى يقوم PDMS بتأمين الإطار.

ثم قم بإزالة الغرفة المكتملة من اللوحة مع توصيل PDMS. لاختبار وظيفة الغرفة المجمعة ، قم بتوصيل الأسلاك البلاتينية بالبطارية واستخدم الفولتميتر للتحقق من تمرير الكهرباء عبر القضبان. الآن انقل الغرف الوظيفية إلى كيس تعقيم واستخدم 20 دقيقة من التعقيم بالبخار عند 121 درجة مئوية لإعدادها لزراعة الخلايا.

لتحضير الجل ، قم بتبريد جميع مكونات الجل على الثلج قبل خلطها في أنبوب معقم. تأكد من إضافة الكولاجين والمصفوفة الخلوية الإضافية أخيرا وخلط المكونات باستخدام سحب العينات. للخلايا لديها خلايا عضلية القلب متمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

اجمع الخلايا ولكل مصنع لتحضير الأسلاك الحيوية قم بإعداد 3.5 ميكرولتر من هلام الكولاجين الذي يحتوي على نصف مليون خلية. استخدم الآن طرف ماصة P10 لتحميل ما يقرب من أربعة ملليلتر من التعليق في قالب القناة بطول 0.5 سم في كل طبق. اضبط موضع الخيط باستخدام ملقط معقم حسب الحاجة حتى يتم شدها بالكامل.

بمجرد بذر الخلايا ، تأكد دائما من إعادة تعليق خليط خلايا الهلام قبل تناول الأوتوكلاف من أجل الحصول على نتائج متسقة. بعد تحميل القنوات ، قم بتغطية الجزء السفلي من الطبق ب PBS معقم مع التأكد من عدم لمس الجل. سيضمن ذلك عدم جفاف الأسلاك الحيوية أثناء البلمرة.

بعد احتضان الأسلاك الحيوية عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، استبدل PBS بوسط ثقافة كاف لتغطية الخلايا. 12 مل عادة ما يكون كافيا. ثم استزراع الطبق لمدة أسبوع لاستبدال الوسط كل يومين.

في خزانة السلامة الحيوية ، أضف ملليلترين من PBS إلى كل بئر من ستة ألواح آبار تحتوي على غرفة محفز كهربائية. ثم استخدم ملاقط معقمة لوضع أجهزة الأوتوكلاف برفق في الآبار. بمجرد الوصول إلى موضعه ، تخلص من PBS واستبدله بخمسة ملليلتر من الوسط الدافئ الذي يجب أن يغطي قضبان الكربون بالكامل.

قبل زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة ، لاحظ انقباض خلايا عضلة القلب استجابة للتحفيز الكهربائي للتأكد من أن الخلايا تلتقط الحافز الكهربائي وتستجيب للتقلصات. بعد ذلك ، ضع الأسلاك الحيوية في غرفة المحفز الكهربائي وقم بتوجيه القنوات بشكل عمودي على قضبان الكربون. قم بتمديد الأسلاك البلاتينية بعيدا عن اللوحة ثم قم بتغطية الألواح.

قم بتوصيل الأسلاك بمحفز كهربائي. اضبط المحفز على توصيل نبضات ثنائية الطور مللي ثانية واحدة عند هرتز واحد وثلاثة فولت لكل سنتيمتر. ثم انقل المستحضرات الموجودة في المحفز الكهربائي إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية.

قم بزيادة معدل التحفيز بشكل تدريجي كل 24 ساعة من هرتز واحد في اليوم صفر إلى ستة هرتز في اليوم السادس. خلال هذا الأسبوع من الثقافة ، قم بتغيير الوسيط كل يومين. ومراقبة انقباض خلايا عضلة القلب على أساس يومي.

بعد سبعة أيام من الزراعة المسبقة في خلايا الأسلاك الحيوية ، أعادت تشكيل الجل حول الخيط. تجمعت الخلايا على طول محور الخيط لتشكيل أنسجة قلبية محاذاة. أظهرت الخلايا التي عبرت عن بروتينات انقباض القلب نطاقا ساركوميريا في الجهاز المقلص وتم محاذاة لييفاتها العضلية على طول محور الخياطة.

أظهرت الخلايا الموجودة في السلك الحيوي معدلات تكاثر أقل من الخلايا الموجودة في الأجسام الجنينية. تم تحسين التعامل مع الكالسيوم بشكل كبير في خلايا عضلة القلب المزروعة في الأسلاك الحيوية. أدى العلاج بالكافيين إلى إطلاق مفاجئ للكالسيوم من الشبكة العجزية.

تم العثور على هذه العابرين فقط في الخلايا المحفزة. كان هناك أيضا تردد تحفيز أعلى بشكل ملحوظ اعتمادا على سعة إطلاق الكالسيوم. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت خلايا عضلة القلب المزروعة في الأسلاك الحيوية كثافة محسنة في hERG وتيار المعدل الداخلي مقارنة بالزراعة في الأجسام الجنينية التي تم تعزيزها بشكل أكبر عن طريق التحفيز الكهربائي.

كان تيار المعدل الداخلي المحسن متسقا مع زيادة التعبير عن جينز قناة التصحيح الداخلي للبوتاسيوم ، KCN J2. كانت القدرة على الضرب التلقائي أعلى بشكل ملحوظ في خلايا عضلة القلب المشتقة من الجسم الجنيني مقارنة بالأسلاك الحيوية الخاضعة للرقابة. أظهر التحكم تلقائية مماثلة لتحضير الأسلاك الحيوية الخاضع لنظام ستة هرتز. بمجرد إتقان إعداد الأسلاك الحيوية يمكن القيام به في نصف يوم.

سيستغرق إعداد التحفيز الكهربائي بضع ساعات ويمكن الوصول إلى النتائج النهائية في غضون أسبوعين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن خلايا عضلة القلب المتمايزة عن خطوط الخلايا المختلفة أو من خلال بروتوكولات مختلفة يمكن أن تختلف قليلا في نضجها ونقاوتها. لذلك قد تكون هناك حاجة إلى تحسين المعلمات التجريبية مثل معدل تحفيز خلاياك.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تحسين الحالات الأخرى بما في ذلك اختلاف التركيب الخلوي واستخدام خلايا عضلة القلب الطافرة للإجابة على مجموعة من الأسئلة الإضافية.