تحديد "قوتها النسبية" من مكافحة-تنف [مونوكلونل] جسم (ماب) قبل Neutralizing تنف استخدام أسلوب بيواناليتيكال في المختبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس الفاعلية النسبية للجزيئات المضادة لعامل نخر الورم ألفا. في هذا المثال ، نقارن اثنين من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة لعامل نخر الورور-ألفا من أجل تحديد كفاءة التحييد لمرجع واحد mAb مقابل عينة mAb قيد التحقيق. يوضح هذا البرنامج التعليمي خطوات مفصلة لتحديد فاعلية تحييد TNF-alpha ، والتي لم يتم تضمينها في الأدبيات.

يمكن أن تتعرض الخلايا للإجهاد بسبب عوامل بيئية مختلفة ، على سبيل المثال ، الجوع. تحتوي كل خلية على بروتينات مختلفة على سطحها تسمى المستقبلات. بعضها خاص بالسيتوكين TNF-alpha.

عندما يتفاعل هذا الجزيء مع مستقبله ويتم تطوير إشارة محددة ، تخضع هذه الإشارات جنبا إلى جنب مع عامل الإجهاد البيئي لموت خلوي مبرمج يسمى موت الخلايا المبرمج. ومع ذلك ، في وجود جزيء مضاد لعامل نخر الورم ألفا يمكن أن يكون جسما مضادا أحادي النسيلة ، يمكن معايرة السيتوكين بواسطة mAb ، والخضوع لعملية تحييد تساعد الخلايا على البقاء على قيد الحياة. وبالتالي ، في ظل منهجية موحدة ، يمكن قياس قوة تحييد الجزيء.

يتم تنفيذ هذا البروتوكول حاليا خلال خمسة أيام. في اليوم الأول ، يجب إعداد حلول لزراعة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، سيتم إذابة خلايا WEHI 164 وزراعتها الفرعية.

في اليوم الثاني والثالث ، يجب التحقق من التقاء الخلايا. بعد هذه الخطوة ، يجب فصل الخلايا وحسابها وتعديل كثافة الخلايا ، وأخيرا ، يجب زراعة الخلايا مرة أخرى. يجب تنفيذ كل هذه الخطوات كل يوم.

في اليوم الرابع ، يجب تحديد تركيز mAb عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية ويجب إجراء تخفيفات الأجسام المضادة. سيتم تحضير حلول تحريض موت الخلايا المبرمج. وأخيرا ، يجب تعديل كثافة الخلايا لخلايا WEHI 164 إلى نصف مليون خلية لكل مل.

في اليوم الخامس ، سيتم تحضير محلول الركيزة للكشف عن الخلايا المبرمجة ، وإجراء التحليل الطيفي الضوئي. أخيرا ، سيتم مناقشة تحليل النتائج في السيليكو. يتم تصوير جميع الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول في هذه الشريحة.

في اليوم الأول ، يجب إعداد هذا الحل مسبقا لتنفيذ البروتوكول باستثناء تحريض موت الخلايا المبرمج ومحاليل الركيزة التي يجب استخدامها مباشرة بعد إعادة التكوين. في بداية هذا البروتوكول ، يجب إزالة الخلايا المجمدة من حاوية النيتروجين السائل. يجب حفظ هذه القارورة التي تحتوي على خلايا WEHI المجمدة على الجليد حتى الاستخدام.

حافظ على مكان عملك نظيفا ومعقما مسبقا لتنفيذ أي نشاط لتجنب انتقال التلوث. انقل رف isotherm إلى غطاء التدفق الرقائقي وقم بتوزيع تسعة مل من وسط الاستزراع المسخن مسبقا في أنبوب معقم سعة 15 مل. باستخدام مل واحد من وسط المزرعة الدافئ مسبقا ، اغسل خلايا WEHI 164 لسحب العينة بلطف من أعلى إلى أسفل حتى تنفصل الخلايا المجمدة عن الأنبوب الدقيق.

امزج عن طريق الانعكاس خمس مرات حتى تذوب الخلايا المجمدة تماما. ثم خلايا الطرد المركزي عند 125 جم لمدة ثلاث دقائق. تخلص من المادة الطافية وقم بتقسيم حبيبات الخلية.

أضف خمسة مل من وسط الثقافة الدافئ مسبقا إلى الأنبوب واخلط المعلق حتى يتم تعليق الخلايا تماما. استعادة الخلايا في قارورة ثقافة T. واحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون عند 5٪ كل يوم قبل فصل ، عد خلايا الزراعة ، من الضروري التحقق من صحة الثقافة تحت المجهر.

يجب على الباحث التحقق من صحة الخلية وقابليتها للحياة وكثافة الخلايا من أجل الزراعة الفرعية. يجب إجراء هذا التحقق أيضا للمقايسة البيولوجية. أولا ، يجب التحقق من عدم وجود تلوث بيولوجي ، على سبيل المثال ، البكتيريا.

ثانيا ، يمكن التحقق من صحة الخلية عن طريق التقاء. التقاء أعلى من 90٪ يكفي لتحقيق نتائج جيدة. ومع ذلك ، إذا لم تصل الخلايا إلى كثافة الخلية المطلوبة ، فيجب إعادة القارورة إلى الحاضنة والانتظار حتى تصل الخلايا إلى كثافة الخلية المطلوبة والتقاء.

يجب إزالة وسط الثقافة القديمة من قارورة T. اغسل الخلايا المرفقة على جدران قارورة T بخمسة مل من محلول غسيل الخلايا. احرص على عدم إزالة الخلايا المرفقة.

امزج يدويا للتخلص من بقايا وسط الاستزراع وحطام الخلايا. يجب تنفيذ هذه الخطوة مرتين. قم بإزالة محاليل الغسيل المتبقية باستخدام الفراغ وأضف ثلاثة مل من محلول انفصال الخلية.

حرك واحتضان خلال ثلاث دقائق. بمجرد الانتهاء من الحضانة ، أضف وسط الثقافة الدافئ مسبقا إلى قارورة T لتعطيل الإنزيم. واستعادة الخلايا.

انقل تعليق الخلية إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي. حدد حبيبات الخلية وتخلص من المادة الطافية. تعد إزالة وسط الاستزراع القديم أمرا بالغ الأهمية لزراعة الخلايا السليمة.

قم بتفكيك حبيبات الخلية وإعادة تكوين الخلايا بخمسة مل من وسط الاستزراع الدافئ مسبقا. انقل 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى أنبوب صغير. عد الخلايا باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.

عد الخلايا وصلاحية خلايا الديتيمين. بمجرد الحصول على عدد الخلايا القابلة للحياة ، اضبط 15 مل من وسط المزرعة على كثافة خلية تبلغ نصف مليون خلية لكل مل باستخدام الصيغة التالية. انقل 15 مل من معلق الخلية المعدل في قارورة ثقافة T واحتضانها طوال الليل.

يجب تكرار عملية الثقافة الشاملة هذه مرة أخرى على الأقل ليصبح المجموع ثلاثة ممرات خلوية قبل البدء في مقايسة التحييد. في اليوم الرابع ، قم بقياس الكثافة البصرية للمادة المرجعية والعينة التحليلية وعينة التحكم عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 280 نانومتر. قم بإجراء تخفيف أولي إلى ملليغرامين لكل مل باستخدام وسيط مزرعة الفحص لكل عينة بواسطة ثلاث نسخ مستقلة.

قم بإجراء تخفيف ثان حتى ميكروغرامين لكل مل لكل عينة مللي أمبير. قم بتوزيع 75 ميكرولترا من وسط ثقافة الفحص إلى 60 بئرا موجودة في منتصف صفيحة البوليسترين الدقيقة. أضف 230 ميكرولتر من المادة المرجعية في الآبار 2B و 2C.

عينات تحليلية في الآبار ، 2D و 2E. وأخيرا ، عينة التحكم في الآبار ، 2F و 2G. عينة التحكم هي جزيء له فاعلية نسبية معروفة.

ثم قم بعمل تخفيفات تسلسلية في الصفيحة الدقيقة. يتم تصوير مثال في الشرائح التالية. تذكر أن تخلط الحلول مسبقا للاستغناء عنها في الآبار.

هذه العملية ضرورية لنجاح هذا البروتوكول. اضبط مسبقا على نصف مليون خلية لكل مل لموزع. أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى 60 بئرا داخليا للوحة الفحص بدءا من العمود الثاني إلى 11.

امزج تعليق الخلية مسبقا لإضافة سائل إلى الصفيحة الدقيقة. انقل على الفور 50 ميكرولترا من تخفيفات mAb إلى لوحة الفحص. بالنسبة للممرات المزدوجة، قم بتوزيع التخفيفات عن طريق تدوير الماصة الدقيقة.

يمكن توزيع مخففات mAb في الآبار بالترتيب التالي ، ويتم توزيع الضوابط في الآبار المحيطة. خفف TNF-alpha ب 500 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. امزج بواسطة خلاط دوامة عند 2200 دورة في الدقيقة.

انقله إلى أنبوب سعة 15 مل وأخيرا ، خفف إلى 40 نانوجرام لكل مل باستخدام وسط ثقافة الفحص. قم بتوزيع 50 ميكرولترا من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج في 60 بئرا داخليا للفحص. قم بتوزيع 50 ميكرولترا من محلول تحريض موت الخلايا المبرمج في 60 بئرا داخليا للفحص.

أخيرا ، احتضن لمدة 16 ساعة. في اليوم الخامس ، أعد تشكيل الركيزة باستخدام هذا المحلول العازل وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة. امزج عن طريق التقليب خمس مرات.

الاستغناء عن محلول الركيزة. وأضف 50 ميكرولترا من محلول الركيزة إلى كل عينة جيدا في لوحة الفحص. أضف أيضا الركيزة إلى الضوابط.

حرك لوحة الفحص في خلاط دوامة بسرعة 400 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق. أخرج لوحة الفحص من الخلاط واحتضانها في درجة حرارة الغرفة. قم بتشغيل قارئ اللوحة - مقياس الطيف الضوئي.

افتح برنامج SoftMax Pro أو أي برنامج مكافئ. قم بتحميل الصفيحة الدقيقة في مقياس الطيف الضوئي واضبط المعلمات التالية. قم بتنشيط وظيفة التلألؤ ووظيفة القراءة من نوع نقطة النهاية.

اضبط منطقة القراءة، باستثناء العمودين الأول و12. حدد نوع اللوحة إلى 96 جيدا قياسيا صفيحة سفلية شفافة. قم بتغيير وقت التكامل حتى 1250 مللي ثانية.

اضبط وقت الاهتزاز للصفيحة الدقيقة على 10 ثوان. حدد البئر الذي سيتم وضع المادة المرجعية والمادة التحليلية وعينة التحكم فيه. ابدأ في القراءة.

النتائج في هذا الاختبار هي منحنيات الاستجابة المعبر عنها في اللمعان مقارنة بمقاييس اللوغاريتمية لتركيز mAb. نقاط الانعطاف لهذه المنحنيات هي التركيزات الفعالة ، EC50 لكل مللي أمبير. يتم التعبير عن C أو EC50 بالنانوجرام لكل مل.

ومع ذلك ، فإن هذه القيمة ليس لها معنى في حد ذاتها ، إذا لم تتم مقارنتها بالعينة المرجعية. وبالتالي ، يتم التعبير عن فاعلية العينة التحليلية بنسبة مئوية وتسمى الفاعلية النسبية. الفاعلية النسبية هي متوسط ثلاث نتائج صفيحة دقيقة مستقلة والتي تأتي وفقا لذلك من قيمة EC50 من كل لوحة.

تساعد المقارنة بين عينات التحكم والعينات المرجعية على تحديد أي انحراف أو تحيز في الفحص الحالي. تساعد مقارنة العينة المرجعية مع العينة التحليلية في تحديد الفاعلية النسبية. يوضح هذا الجدول الفاعلية النسبية ل mAbs وفاصل الثقة الخاص به عند 95٪ كما يعرض الانحراف المعياري النسبي عن كل عينة تتعلق بفاعلية المادة المرجعية.

الانحراف المعياري النسبي فوق 15٪ غير مقبول. يساعد هذا التوصيف على تحديد السلوك الحيوي للجزيء قيد التطوير قبل إجراء تجارب سريرية باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا. كما أنه مفيد لإصدار منتج معتمد من دفعة إلى دفعة.

نحن نقرر أن هذه المقايسات مفيدة لتحديد ما إذا كان للجزيء تأثير بيولوجي مناسب فيما يتعلق بآلية عمله. كجزء من الأساليب الفيزيائية الحيوية ، فإن هذه المنهجية قادرة على تحديد فاعلية وفعالية جودة الدواء وصفاته بالوسائل البيولوجية وبالتالي إظهار أهمية كاملة وكاملة لوظائفه المستجيبة.