تبسيط خلية مفردة تكر العزلة وتوليد نواقل فيروسات النسخ العكسي في المختبر و في فيفو التعبير لتكرس البشرية

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل ذخيرة TCR alpha و beta لمجموعة محددة من المستضد ، بالإضافة إلى وظيفة في الجسم الحي ل TCRs البشرية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في الكفاءة العالية نسبيا لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بالإضافة إلى توافقه مع استنساخ TCR اللاحق. يستخدم هذا البروتوكول PCR المكون من خطوتين لتضخيم سلاسل TCR alpha و beta من خلية واحدة دون معرفة مسبقة بتسلسل TCR.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول هو تفاعل متعدد الإرسال باستخدام مجموعة من الاشعال الخاصة بالمنطقة المتغيرة ألفا أو بيتا جنبا إلى جنب مع برايمر خاص بالمنطقة الثابتة. تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني هو تفاعل متداخل ينطلق من تسلسل المحول المدمج في الطرف الخامس الأساسي لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بالإضافة إلى تسلسل منطقة ثابتة داخلية. تتضمن هذه البادئات أيضا مواقع تقييد فريدة في النهايات الأولية الخمسة والثلاثة الرئيسية لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل لتسهيل الاستنساخ اللاحق.

بمجرد استنساخه في متجه القالب ، يكون تسلسل TCR المشفر خياليا ، ويتكون من مناطق متغيرة بشرية مع مناطق ثابتة متطابقة. يسمح بناء TCR الخيالي بالتفاعل بين TCR ومركب إشارات CD3 المتطابق ، مما يجعل بروتوكول استنساخ TCR هذا متوافقا مع الدراسات الوظيفية اللاحقة في خطوط الخلايا المتطابقة وفي نماذج الماوس المتوافقة مع البشر. قم بالإعداد لفرز الخلية الواحدة عن طريق إعداد كواشف النسخ العكسي في منطقة نظيفة وخالية من القوالب.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل أحادية الخلية بسبب المستويات المنخفضة للقالب. من ناحية أخرى ، فإن حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال حساسة للمستويات المنخفضة من تلوث القالب. لذلك ، من الضروري تنظيف المناطق التي ستقوم فيها بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل تماما.

استخدام خليط من ثلاثة بادئات عكسية خاصة بالمنطقة الثابتة لسلاسل ألفا وبيتا في هذا التفاعل. قم بإعداد المزيج الرئيسي للنسخ العكسي عن طريق الجمع بين الكواشف في خزان سحب العينات. لحساب خطأ سحب العينات، اصنع خليط تفاعل كاف لعشرة آبار إضافية.

استخدم ماصة متعددة القنوات لسحب ستة ميكرولترات لكل بئر في لوحة PCR سعة 96 بئرا. قم بتغطية الطبق بشكل غير محكم بختم واحتفظ بالطبق على الجليد. قم بإعداد الخلايا التائية لفرز الخلية المفردة عن طريق تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة لعلامات سطح الخلية.

قم بفرز الخلايا التائية في خلية واحدة لكل بئر مع ترك الصف الاثني عشر فارغا ، والذي سيكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. أغلق اللوحة بغشاء لاصق وقم بتدويرها عند 1000 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بتشغيل تفاعل النسخ العكسي على الفور.

إذا أمكن ، قم بتشغيل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول في نفس اليوم. لتشغيل تفاعل تعدد الإرسال، امزج خلطات V alpha وV beta PCR الرئيسية بشكل منفصل في خزانات سحب العينات. احتفظ باللوحة مع (كدنا) على الجليد أو على كتلة باردة.

انقل 22.5 ميكرولتر من تفاعل TCR beta إلى لوحة PCR جديدة مكونة من 96 بئرا. ثم استخدم قناة متعددة لنقل 2.5 ميكرولتر من (كدنا) إلى لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استخدم ماصة متعددة القنوات لسحب 22.5 ميكرولتر من تفاعل ألفا TCR مباشرة في اللوحة التي تحتوي على ما تبقى من الحمض النووي (كدنا

أغلق الألواح بمادة لاصقة ، ودوامة برفق ، ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة. قم بتشغيل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول. يمكن تخزين الأطباق عند 20 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة الثانية. باستخدام متعدد القنوات، قم بخلط الماصة الرئيسية لتفاعلات TCR alpha و TCR beta عند 22.5 ميكرولتر لكل بئر في لوحين جديدين PCR سعة 96 بئرا. أضف قالب تفاعل PCR متعدد الإرسال بمعدل 2.5 ميكرولتر لكل بئر.

أغلق الألواح ، ودوامة برفق ، ثم قم بتدويرها لفترة وجيزة. يجب إغلاق تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الأول المتبقي وتخزينه عند 20 درجة مئوية ليكون بمثابة مصدر لقالب النسخ الاحتياطي. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني.

بعد اكتمال تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل الثاني ، نفد خمسة ميكرولترات من التفاعل على هلام الاغاروز بنسبة 1٪. قم بتضمين آبار التحكم الإيجابية والسلبية. يجب أن يعمل النطاق المتوقع بحجم حوالي 500 زوج أساسي.

قم بتنقية ما تبقى من التفاعل الثاني ، عشرين ميكرولترا ، باستخدام مجموعة تنقية PCR بتنسيق 96 بئرا وقم بإجراء تسلسل Sanger. يمكن تحليل تسلسل TCR الذي تم الحصول عليه باستخدام برنامج الوراثة المناعية المتاح عبر الإنترنت. يمكن استخدام معلومات التسلسل لتقييم ذخيرة واستنساخ مجموعة الخلايا التائية.

يمكن استخدام تسلسلات ألفا وبيتا TCR المقترنة في مزيد من التحليل الوظيفي. قم بإجراء روابط متتالية ل TCR beta و TCR alpha في متجه القالب. يتم استبدال القالب TCR beta و TCR alpha بسلاسل تضخيم PCR.

في الربط الأول ، يتم استبدال نموذج TCR beta بسلسلة بيتا المضخمة PCR. بعد التحقق من الإدراج الناجح لبيتا TCR عن طريق تسلسل ملخص الاختبار ، استبدل قالب TCR alpha بسلسلة ألفا المضخمة PCR. تستخدم خلايا HEK293T لاختبار الاقتران الناجح لسلسلة TCR والتعبير عن سطح الخلية.

يتم نقل الخلايا HEK293T مع متجه TCR الذي تم تمييزه بواسطة مراسل فلورسنت الأميترين وناقل يشفر مركب CD3 المميز ب GFP. يتم التحقق من التعبير السطحي ل TCR الخيمري عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق تلطيخ الخلايا بجسم مضاد CD3 مضاد للفأر. يجب أن يكون مستوى تعبير CD3 السطحي في الخلايا المنقولة باستخدام بنية TCR الخيالي مشابها لتلك التي تم نقلها باستخدام متجه قالب التحكم المتطابق بالكامل.

باختصار ، وصفنا بروتوكولا فعالا قائما على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتحديد واستنساخ سلاسل TCR المزدوجة من الخلايا المفردة. نتوقع أن تكون هذه أداة قيمة لدراسة استجابات الخلايا التائية البشرية في المناعة الذاتية ومراقبة الورم والقضاء على مسببات الأمراض. الميزة الرئيسية لبروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل الموصوف هنا هي توافقه مع الدراسات اللاحقة في المختبر وفي الجسم الحي.