تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

الهدف العام من هذه التجربة هو تصور تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي في سقالات ثلاثية الأبعاد في الوقت الفعلي عن طريق الفحص المجهري متعدد الفوتونات. هذه القياسات هي سؤال رئيسي في مجال توليد العظام مثل كيفية تحييد وخداع تكوين الأوعية الدموية في الجسم الحي في سقالات ثلاثية الأبعاد في الوقت الفعلي. الميزة الوحيدة لهذه التقنية هي أنها تمكنها من تحييد CERES والمقاييس خارج الخلية والشبكات الجزيئية المحيطة في نفس الوقت في الجسم الحي.

للبدء ، قم بإعداد محلول متجانس يحتوي على 20 جراما من PLGA و 20 مل من 1 ، 4 ديوكسان. ثم أضف جرامين من مسحوق nHAP إلى المحلول. باستخدام محرك مغناطيسي ، امزج التعليق بقوة عند 1500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة لتشكيل عجينة موحدة سيتم استخدامها لطباعة سقالات PLGA NHAP المسامية.

بمجرد الطباعة ، قم بتجفيف السقالات بالتجميد لمدة 48 ساعة لإزالة أي مذيب تماما. ثم قم بتعقيمها في 75 في المائة من الإيثانول لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بتثبيتها مرة أخرى للحصول على مادة مطهرة محايدة.

بعد ذلك ، أضف أربع نقاط خمسة في 10 إلى خمس جزيئات الفيروس إلى كل سقالة واسمح للجزيئات بالامتصاص في حاضنة رطبة تحافظ على 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. الآن بعد أن تم امتصاص جسيمات الفيروسات على السقالات ، اغسل السقالات مرتين باستخدام ملليلترين من PBS لإزالة أي بقايا غير مرتبطة. قم بتجميد السقالات المغسولة في النيتروجين السائل.

وبعد التحليل مرة أخرى ، قم بتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمزيد من الدراسات. انقل السقالات ثلاثية الأبعاد المغلفة مسبقا بأربع نقاط خمسة في عشرة إلى جزيئات الفيروسات العدسية الخامسة التي تحمل بروتين الفلورسنت الأخضر في قوارير مبردة من نقطتين صفر ملليلتر مملوءة بمليلتر واحد من DMEM الكامل واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة خمسة أيام. كل اثنتي عشرة ساعة من الحضانة ، اجمع عينة واحدة من الوسائط التي تحتوي على جزيئات عدسية متفرجة من السقالات ، واستبدلها بمليلتر واحد من الوسائط الجديدة.

لتحويل الخلايا HEK293T ، قم أولا بإزالة الوسط من الخلايا HEK293T المزروعة في صفيحة 12 بئر واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الوسائط التي تم جمعها مسبقا إلى خلايا HEK293T المغسولة واحتضن اللوحة لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة. بعد 48 ساعة من الحضانة ، قم بقياس عدد خلايا HEK293T إيجابية GFB عن طريق قياس التدفق الخلوي لتحديد عدد الجسيمات الفيروسية النشطة بيولوجيا.

للبدء ، قسم C57 ستة فئران سوداء بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات علاجية: التحكم ، ودرجة الحموضة ، و PHp لكل منها 14. احلق جلد رأس الفأر المخدر وقم بتطهير السطح بصبغة اليود ثم محلول كحول بنسبة 75 بالمائة. ضع رأس الماوس في أداة تجسيمية وقم بقياس حجم الجلد بمشرط ثم باستخدام المقص ، قم بعمل قطع خطي بطول سنتيمتر واحد.

باستخدام قطعة قطن معقمة ، اكشط السمحاق من عظم الجمجمة للكشف عن سطحه. ثم ، على الجانب الأيسر من الجمجمة ، قم بإنشاء عيب في الحجم الحرج بقطر أربعة ملليمترات باستخدام تريفين بور. زرع السقالة في جانب عيب العظام.

استخدم ملقط العين لتغطية موقع الجراحة برفق بالسمحاق. بعد ذلك ، أغلق الجرح عن طريق وضع ثلاث غرز لكل سنتيمتر من الشق. أخيرا ، قم بإعطاء البوبرينورفين المسكن للسيطرة على آلام ما بعد الجراحة وإبقاء على وسادة تدفئة للحفاظ على درجة حرارة جسمه حتى يستيقظ.

عندما يستعيد الفأر وعيه ، قم بتزويده بالطعام والماء وراقب نشاطه اليومي حتى نهاية التجربة. بعد تجميع نظام الفحص المجهري متعدد الفوتون للتصوير TPEF و SHG ، قم بضبط ليزر الياقوت المصنوع من التيتانيوم الفيمتو ثانية إلى 860 نانومتر. لتصور الأوعية الدموية المشكلة حديثا ، قم بحقن الفأر عن طريق الوريد ب 200 ميكرولتر من محلول ديكستران 10 ملليغرام لكل مليلتر في محلول ملحي ، ثم باستخدام الأداة التجسيمية ، قم بتثبيت المخدر على لوح تسخين للحفاظ على درجة حرارة جسمه عند 37 درجة مئوية.

حقن الماوس ب 200 ميكرولتر من المحلول الملحي داخل الصفاق لمنع الجفاف. أخيرا ، زود بمزيج بنسبة ثلاثة بالمائة من الأيزوفلوران في 100 في المائة من الأكسجين للحفاظ على التخدير الكافي والتسكين أثناء التصوير. لبدء التصوير ، امسح زوجا من مرايا galvo لإنشاء منطقة أخذ عينات 512 × 512 ميكرومتر.

بعد ذلك ، باستخدام عدسة موضوعية للغمر في الماء NA ذات نقطة واحدة ، قم بتركيز شعاع الإثارة على العينة واجمع إشارة TPEF HSG المتناثرة الخلفية. اضبط مجال الرؤية بحيث يغطي منطقة العظام الطبيعية وحافة العيب في المجموعة الضابطة ، ولكن فقط السقالة المزروعة عند تصوير من مجموعة PH أو PHp. بعد ذلك ، افحص خمسة مواقع مختلفة للعيب.

احصل على مكدسات الصور كل 12 ثانية خلال فترة تصوير مدتها ساعتان. يتم تقديم صورة فوتوغرافية للسقالة المعدة بتقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، جنبا إلى جنب مع صورة التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة التي توضح المسامية الإجمالية للمادة المحضرة. يظهر الهيكل الصغير الذي يسهل اختراقه للسقالة في صورة SEM التي تم الحصول عليها بتكبير 5000 مرة.

كما هو موضح ، عبرت الخلايا HEK293T المعالجة بوسائط تحتوي على جزيئات فيروسات عدسية منبعثة من السقالات بكفاءة عن البروتين الفلوري الأخضر. وفقا لتقديرات قياس التدفق الخلوي ، بلغ العدد الإجمالي للجسيمات المنبعثة حوالي 40 بالمائة. لوحظ أقوى تأثير إطلاق خلال ال 24 ساعة الأولى من الدراسة ، وانخفض تدريجيا بمرور الوقت ، مما يؤكد أن جزيئات الفيروسات العدسية المغلفة على السقالات تحافظ على نشاطها البيولوجي لمدة تصل إلى 96 ساعة.

أظهر تحليل الأوعية الدموية المتكونة داخل عيب عظمي في الجسم الحي أن الأوعية الدموية الجديدة ، على الرغم من عدم اكتشافها في المجموعة الضابطة من الفئران ، كانت مرئية بوضوح في كل من مجموعات PH و PHp بعد ثمانية أسابيع من زرع السقالة. بالإضافة إلى ذلك ، بينما تم اكتشاف العديد من مواقع ترسب الكولاجين في كل من مجموعات PH و PHp ، فقط في مجموعة PHp يمكن ملاحظة عدد متزايد من الأوعية الصغيرة التي تنمو إلى سقالات وكانت مساحة الأوعية الدموية الإجمالية مختلفة بشكل كبير. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تثبيت رأس الماوس لإبقائه ثابتا أثناء المسح لتجنب أي قطع أثرية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير الضوئي الصوتي من أجل توفير بيانات إضافية مثل صور الأنسجة العميقة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد العظام للتحقيق في تكوين الأوعية الدموية في عمليات الزرع.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور تكوين البلازما في الجسم الحي في سقالات ثلاثية الأبعاد في الوقت الفعلي ، والفحص المجهري للفوتون الدقيق.