كشف وإثراء نادر محددة مستضد الخلايا B لتحليل النمط الظاهري وظيفة

الهدف العام من هذا الإجراء البسيط والفعال هو عزل وإثراء الخلايا البائية النادرة المرتبطة بالمستضد من الدم المحيطي البشري باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية لتحليلها الظاهري والوظيفي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة فيما يتعلق بالنمط الظاهري وبيولوجيا الخلايا البائية النادرة المرتبطة بالمستضد قبل وبعد مواجهة مستضد في الجسم الحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب المشكلات المرتبطة بالهندسة ، خاصة عندما يستخدم المرء صفيحة ستايرين أو حبة كبيرة.

وهو يتجنب المشاكل المرتبطة بمعدل التدفق عندما يقوم المرء بعزل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي لعزل الخلايا النادرة في مجموعات كبيرة جدا من الخلايا البدائية. مباشرة بعد جمع 30 إلى 50 مل من الدم الكامل في أنابيب جمع الدم الهبارين ، امزج الدم بنسبة 1: 1 مع المغنيسيوم المعقم بدرجة حرارة الغرفة و PBS الخالي من الكالسيوم. بعد ذلك ، ضع طبقة من خليط الدم على 10 ملليلتر من محلول التدرج بكثافة درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مليلتر باستخدام ضغط زناد ماصة بطيء متسق.

افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي. تخلص من الطبقة العليا المحتوية على البلازما والصفائح الدموية واستخدم ماصة معقمة لنقل طبقة العبوة من حاوية الخلية أحادية النواة إلى أنبوب معقم جديد سعة 50 ملليلترا. املأ الأنبوب بما يصل إلى 50 مل من PBS لغسل الخلايا أحادية النواة عن طريق الطرد المركزي.

بعد ذلك ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من PBS الطازج للعد وإعادة تعليق الخلايا عند 1 × 10 ^ 7 خلايا لكل تركيز مليلتر في PBS الطازج على الجليد. لتلطيخ الخلايا من أجل ربط الخرزة المغناطيسية ، قم أولا بنقل 1-2 × 10 ^ 6 خلية إلى خمسة أنابيب بوليسترين ملليلتر لكل تعويض مضان وتحكم مضان ناقص واحد حسب الاقتضاء. بعد ذلك ، اجمع ما تبقى من عينة الخلية عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات إلى 3-6 × 10 ^ 7 خلايا لكل تركيز مليلتر في مخزن FACS بارد مفلتر معقم.

قسم محلول الخلية بالتساوي إلى أربعة أنابيب FACS على الجليد وأضف مستقبلات Fcgamma البشرية التي تمنع reagant إلى كسور العينة التجريبية الأربعة هذه. في نهاية حضانة حجب الارتباط غير المحدد ، أضف الأجسام المضادة المناسبة لتلوين سطح الخلية المترافقة الفلورية إلى الخلايا في جميع أجزاء العينة الأربعة. بعد ذلك ، أضف المستضد البيوتينيل المناسب إلى الكسرين A و D متبوعا بإضافة حجم كاف من المستضد غير المسمى إلى الكسر B بحيث يتم حظر غالبية المستقبلات التي يبلغ تقاربها لا يقل عن 1x10 ^ 6 مولار.

احتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة على الجليد متبوعا بحضانة الكسر B لمدة 30 دقيقة مع مستضد البيوتينيل المناسب. في نهاية الحضانات ، اغسل الخلايا مرتين في مليلتر واحد من عازلة FACS المثلجة لكل 5 × 10 ^ 7 خلايا. وأعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من 2٪ فورمالديهايد لكل 5 × 10 ^ 7 خلايا لمدة خمس دقائق في الظلام على الجليد.

بعد التثبيت ، اغسل الخلايا مرتين أخريين كما هو موضح للتو. وأعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من محلول FACS البارد الطازج لكل 5 × 10 ^ 7 خلايا. ثم قم بتسمية الخلايا بميكروغرام إلى ميكروغرام من الجسم المضاد المترافق الثانوي المناسب للستربتافيدين لمدة 20 دقيقة في الظلام على الجليد وغسل الخلايا مرتين أخريين.

للتخصيب القائم على الجسيمات النانوية المغناطيسية ، أعد تعليق كسور الخلايا A و B و C في مليلتر واحد من عازلة الفصل البارد لكل خلايا 5x10 ^ 7 وقم بتصفية الخلايا من خلال مصافاة فردية سعة 40 ميكرولتر للتخلص من أي كتل. بعد ذلك ، أضف الجسيمات النانوية للصبغة الفلورية بالتركيز المناسب لمدة 10 دقائق في الظلام عند أربع درجات مئوية مع الدوران واغسل العينات مرتين في مليلتر واحد من عازلة الفصل الباردة. أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من عازلة الفصل البارد لكل 5 × 10 ^ 7 خلايا.

ثم قم بموازنة ثلاثة أعمدة مغناطيسية على مغناطيسها ذي الحجم المناسب مع ثلاثة ملليلتر من الفصل المؤقت لكل منها ، مما يسمح بالحجم الكامل لمخزن الفصل بالمرور عبر كل عمود في حاوية نفايات. الآن ضع أنبوبا مخروطيا واحدا يسمى 15 مليلتر تحت كل عمود وأضف الخلايا المسماة بالجسيمات المغناطيسية إلى أعمدة كل منها. عندما يمر الحجم الكامل لكل جزء من الخلية عبر كل عمود ، أضف ثلاثة ملليلتر من عازلة فصل الجليد البارد الطازج إلى الجزء العلوي من كل عمود ، وجمع النفايات السائلة في الأنابيب المصنفة.

بعد تصريف الغسيل الثاني تماما من خلال الأعمدة ، ضع أنابيب الخلايا المختارة سلبا من كل جزء على الجليد وانقل الأعمدة إلى أنابيب جديدة سعة 15 مليلتر لكل جزء. املأ كل عمود بحوالي ستة ملليلتر من الفصل المؤقت الطازج وقم بغمر المخزن المؤقت على الفور عبر الأعمدة لجمع الخلايا المرتبطة مغناطيسيا. ثم اجمع كل من كسور الخلايا الموجبة والسالبة عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الكريات في الحل المناسب لتحليل المصب المخطط له.

في هذه الرسوم البيانية ، يوضح تواتر الخلايا البائية التفاعلية للكزاز وذيفان الكزاز من فرد تم تطعيمه آخر مرة ضد الكزاز منذ أكثر من عقد من الزمان قدرة هذه الطريقة على استخدامها لإثراء الخلايا المرتبطة بذيفان الكزاز حوالي سبعة أضعاف بنقاء حوالي 4٪ إضافة 50 ضعفا من ذيفان الكزاز غير المسمى إلى الخلايا من شخص تم تطعيمه قبل حوالي ثلاث سنوات من سحب الدم. قبل إضافة مستضد البيوتينيل ، ينخفض ارتباط ذيفان الكزاز بنسبة 83٪ مما يدل على خصوصية ارتباط المستضد. عندما يتم حذف المستضد الحيوي من الإجراء ، لا يزال 0.2٪ فقط من الخلايا البائية مرتبطة ، على الأرجح ، مما يعكس ارتباط بعض المستضد غير الكزاز في المادة الماصة.

توضح هذه الرسوم البيانية كيف ينخفض تواتر الخلايا البائية الساذجة الخاصة بذيفان الكزاز من عينة دم تم سحبها بعد سبعة أيام من التطعيم المعزز لشخص سليم ، من 84٪ إلى 64٪ بعد التعزيز. بينما تزداد نسبة الذاكرة والبلازما من 16٪ إلى 36٪ ومن صفر إلى 40٪ على التوالي. علاوة على ذلك ، توضح بيانات ELISPOT التمثيلية من عينة دم محيطية تم الحصول عليها بعد سبعة أيام من التعزيز من شخص سليم التخصيب بأربعة أضعاف في تردد الخلايا التي تفرز الأجسام المضادة للكزاز والذيفان التي لوحظت في الخلايا البائية المعزولة المرتبطة بذيفان الكزاز.

بمجرد إتقان هذه التقنية ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي ثلاث إلى أربع ساعات مع جميع عناصر التحكم المناسبة. يمكن دمج الطريقة مع المقايسات الثانوية ، على سبيل المثال ، نقل الخلايا إلى متلقين معتمدين للدراسات اللاحقة لمصير الخلية ووظيفتها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وإثراء الخلايا البائية النادرة المرتبطة بالمستضد من الدم المحيطي البشري باستخدام الضوابط المناسبة.