الكمي المطلق للAβ _1-42 في السائل الدماغي الشوكي عن طريق مرجع إجراء قياس كتلة الطيف

العام من إجراء القياس المرجعي هذا هو تنسيق قياسات بيتا في السائل الدماغي النخاعي البشري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توحيد المقايسات لقياس السائل الدماغي النخاعي ، وهو بيتا 42 ، وهو مؤشر حيوي لأمراض الأميلويد المركزي والسمة المميزة العصبية المرضية لمرض الزهايمر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه تم التحقق من صحتها بدقة ولا تستخدم الأجسام المضادة لقياس AVR 142.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج مرض الزهايمر لأنها ستستخدم لتنسيق المقايسات وتسهيل إدخال مستويات القطع العامة في التجارب السريرية. في حين أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأمراض الأميلويد لدى البشر ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية المميتة الأخرى مثل الفئران المعدلة وراثيا والرئيسيات غير البشرية لابتكار أدوية جديدة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن AVR 142 كاره للماء للغاية ويمكن أن يلتصق بسهولة بالأسطح مثل أطراف وأنابيب الماصات.

أولا ، أضف 40 ميكرولترا من N15 وهو ببتيد بيتا إلى 0.46 مل من 20٪ أسيتونيتريل و 4٪ أمونيا مركزة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر. اخلطي محلول الببتيد في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. أضف 50 ميكرولترا من محلول الببتيد إلى 1.95 مل من الأسيتونيتريل 20٪ والأمونيا المركزة 4٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلتر.

اخلطي محلول الببتيد في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بإعداد ستة حلول معايرة عن طريق خلط الأحجام المناسبة لكل محلول في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. بعد خلط محاليل المعايرة ، قم بإعداد أجهزة المعايرة النهائية في نسختين عن طريق خلط الأحجام المناسبة لمحاليل المعايرة المقابلة والسائل الدماغي النخاعي البشري في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 0.5 ملليلتر.

امزج كل محلول في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. لإعداد المعيار الداخلي ، أضف أولا 32 ميكرولترا من 13 درجة مئوية من ببتيد بيتا إلى 1.968 مل من 20٪ أسيتونيتريل و 4٪ أمونيا مركزة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترتين. اخلطي محلول الببتيد في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة.

بعد ذلك ، أضف 0.1 مل من محلول الببتيد إلى 4.9 مل من الأسيتونيتريل 20٪ والأمونيا المركزة 4٪ في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق سعة خمسة ملليلتر. اخلطي محلول الببتيد في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. لتحضير عينة عامل الاستجابة ، أضف 40 ميكرولترا من ببتيد بيتا الأصلي إلى 0.46 مل من 20٪ أسيتونيتريل و 4٪ أمونيا مركزة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر.

بعد الخلط ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الببتيد و 20 ميكرولترا من أربعة ميكروغرام لكل مليلتر ، و 15N ببتيد بيتا إلى 1.96 ملليلتر من 20٪ أسيتونيتريل و 4٪ أمونيا مركزة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة ملليلترين. اخلطي محلول الببتيد في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، أضف 20 ميكرولترا من محلول الببتيد إلى 0.38 مل من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر.

بعد تحضير التكرارات ، اخلطي كل محلول في خلاط دوامة لمدة دقيقة واحدة. بعد إذابة العينات على الأسطوانة ، أضف 0.18 مل من كل جهاز معاير وعامل استجابة وعينة غير معروفة إلى لوح بئر عميق مكون من بروتين واحد مليلتر 96 ، مع التأكد من إضافة العينات في قاع الآبار أو بالقرب منه. الآن ، أضف 20 ميكرولترا من المعيار الداخلي إلى كل بئر عن طريق إطلاق قطرة من المعيار على جانب البئر بالقرب من سطح العينة دون غمر طرف الماصة.

ثم أضف 0.2 مل من خمسة مولات غوانادين هيدروكلوريد إلى كل بئر. ضع لوحة العينة على شاكر دقيق واخلط العينات لمدة 45 دقيقة عند 1100 دورة في الدقيقة. بعد الخلط ، أضف 0.2 مل من 4٪ حمض الفوسفوريك إلى كل بئر.

بعد ذلك ، ضع لوحة العينة على شاكر الصفيحة الدقيقة واخلطها لفترة وجيزة عند 1000 دورة في الدقيقة. ضع صينية خزان للنفايات تحت تبادل الكاتيون 96 بئر ، أو لوحة SPE في غرفة مشعب لوحة الاستخراج. بعد ذلك ، قم بتكييف مادة ماصة SPE بإضافة 0.2 مل من الميثانول إلى كل بئر.

بعد ذلك ، قم بموازنة المادة الماصة بإضافة 0.2 مل من 4٪ حمض الفوسفوريك إلى كل بئر. باستخدام ماصة ثماني قنوات ، انقل جميع العينات من لوحة البئر العميقة إلى لوحة SPE. بعد ذلك ، اغسل المادة الماصة مرتين بعد مرور العينات بإضافة 0.2 مل من 4٪ حمض الفوسفوريك إلى كل بئر.

بعد أن يتخلص مذيب الغسيل من المادة الماصة ، استبدل صينية الخزان بأنابيب. الآن ، قم بإزالة العينة من المادة الماصة عن طريق إضافة اثنين من 50 ميكرولتر من الأمونيا المركزة 75٪ الأسيتونيتريل و 10٪ الأمونيا المركزة ، مع ملاحظة أن هذا المحلول يتطلب فراغا منخفضا جدا للمرور عبر المادة الماصة. جفف المصفاة باستخدام الطرد المركزي الفراغي دون استخدام الحرارة.

أخيرا ، أغلق الأنابيب وقم بتجميدها عند 80 درجة مئوية حتى التحليل. المعايرات قريبة من خط الانحدار مع انحرافات معيارية منخفضة. إذا كانت المعايرة غير خطية، فيجب تجاهل التشغيل ويكون الانحراف على الأرجح بسبب تقنيات سحب العينات غير الصحيحة و/أو الأخطاء في تخفيف أجهزة المعايرة.

يفضل أن يكون معامل تباين التكرارات أقل من 10٪ 15N و 13C الأصليين 15N و 13C ، بيتا من عمود LC في وقت واحد مع قمم قريبة من المتماثل وبدون مخلفات كبيرة. يجب إجراء ما لا يقل عن 10 قياسات لكل ذروة ويمكن تعديلها بحد أقصى لوقت الحقن في الطريقة. يمكن قياس الببتيدات في وقت واحد أثناء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد ما لم تكن حساسية الطريقة دون المستوى الأمثل ، حيث يجب قياس الببتيدات ذات الأهمية فقط لكل حقنة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما تشبع أطراف الماصة قبل نقل محلول الببتيد. من المهم أيضا استخدام الأنابيب ذات الحجم الفراغي الأقل قدر الإمكان.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مرض الزهايمر لاستكشاف التوافق مع الطرق الأخرى ، مثل تصوير الأميلويد المقطعي بالإصدار البوزيتروني. كما تم استخدامه لتعيين تركيزات بيتا 142 للمواد المرجعية القائمة على السائل الدماغي النخاعي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أجهزة المعايرة في السائل الدماغي النخاعي البشري واستخدام استخراج الطور الصلب قبل تحليل LCMS لقياس التركيز المطلق لبيتا 142 في العينات.

لا تنس أن العمل مع السائل الدماغي النخاعي البشري يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل القفازات والنظارات الواقية وتدابير السلامة الأخرى أثناء تنفيذ هذا الإجراء.