استخدام في المختبر خلية يعيش التصوير لاستكشاف تشريعات تسليمها بالقاعدة الدهنية جسيمات نانوية

الهدف العام من تقنية تصوير الخلايا الحية هذه هو تتبع العمليات الخلوية، مثل امتصاص وتوزيع العوامل العلاجية الكيميائية دون الحاجة إلى التثبيت. ويمكن لهذه الطرق أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال السرطان، مثل: كيفية امتصاص الخلايا الورمية للعوامل العلاجية الكيميائية، سواء كانت في شكلها الحر أو مغلفة في جسيمات نانوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أننا نقوم بتصوير خلايا حية، مما يمنع حدوث شوائب التثبيت ويسمح بالتقييم الديناميكي في الوقت الفعلي.

طَرَأت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن الجسيمات النانوية تتفكك أثناء عملية التثبيت، مما أدى إلى تفسير خاطئ لعملية إيصال الدواء. لتجميع غرفة التصوير، ضع شريحة غطاء زجاجية بمقاس 25 millimeter في الجزء السفلي من الغرفة، ثم اربط الجزء العلوي بالجزء السفلي. تجنب الإفراط في الربط حتى لا ينكسر الزجاج.

قم بتعقيم الغرفة بأكملها باستخدام الموصدة (Autoclave). لزراعة الخلايا، أخرج غرفة التصوير من حقيبة التعقيم داخل خزانة التدفق الصفائحي (Laminar Flow Cabinet). أحكم غلق الغرفة بعناية ثم ضعها في طبق بتري.

قم بطلاء زجاج غرفة التصوير بـ 1 mL من الجيلاتين المعقم بتركيز 0.1% لمدة 20 دقيقة عند 37 °C و 5% Carbon Dioxide. بعد إزالة الوسط من دوارق زراعة الخلايا، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS وقم بفصل الخلايا باستخدام Trypsin بتركيز 0.25%. قم بتثبيط مفعول Trypsin عن طريق إضافة وسط زراعة الخلايا.

بعد ذلك، يتم جمع الخلايا وطردها مركزياً عند 1,100 Gs لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الراسب في 5 mL من وسط زراعة الخلايا. بعد عد الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بشفط الجيلاتين وزرع الخلايا بتخفيف يسمح بتغطية قصوى تبلغ 70% في غضون 24 ساعة.

اترك الخلايا لتلتصق في بيئة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بتقييم الخلايا تحت المجهر للتحقق من درجة التلاقي، والمورفولوجيا الخلوية، والتلوث. بعد ذلك، قم بتشغيل المجهر البؤري، والضوء الفلوري، وجهاز الكمبيوتر.

قم بتوصيل سخان العدسة بالعدسة الشيئية واضبطه على 35 درجة. جهز وحدة الحضن كما هو موضح في البروتوكول النصي. ضع وحدة الحضن على منصة المجهر وقم بتوصيل أنبوبي تدفق ودخول ثاني أكسيد الكربون.

افتح صمام ثاني أكسيد الكربون الرئيسي وقم بتشغيل وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون. تحقق من ضبط وحدة التحكم على 5% من ثاني أكسيد الكربون. تعد ظروف زراعة الخلايا المناسبة، مثل درجة الحرارة، وCO2، وpH، والرطوبة، والتعقيم، أمراً بالغ الأهمية للتصوير الخلوي طويل الأمد.

لذلك، يجب اختبار كل حاضنة بشكل صحيح. اضبط درجة حرارة المرحلة على 37 درجة Celsius. اترك وحدة التحضين حتى تصل إلى درجة الحرارة المختارة ونسبة Carbon Dioxide المطلوبة.

أخرج غرفة التصوير من حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرئيسية وانقل الغرفة في طبق بتري إلى غرفة المجهر. ضع غرفة التصوير في حامل مسرح مخصص بقطر 35 مليمتر وأغلق الغرفة بغطاء إحكام مخصص. افتح وحدة التحضين، وبسرعة قصوى لمنع تبريد الخلايا؛ استبدل الرقعة الحمراء بغرفة التصوير ثم أغلق الوحدة.

تأكد من عدم وجود كابلات عالقة بين المنصة والمجهر. اترك الوحدة لتتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، افتح البرنامج وقم بتشغيل الليزر.

قم بإنشاء قاعدة بيانات جديدة بالنقر على "New" تحت علامة التبويب "File". قم بتسمية قاعدة البيانات وحفظها. اضبط الإعدادات بالنقر على "Config" تحت علامة التبويب "Acquire".

اختر "Channel Mode" و"Single Track" لتقييم فلوروفور واحد. اختر "Multi Track" لعدة فلوروفورات. ثم اختر مرشحات تمرير النطاق (band-pass filters) المناسبة التي تطابق الفلوروفور.

حدد قناة المجال المضيء (bright field) في أحد المسارات. تتأثر عملية المسح بالتوازن بين الإشارة الفلورية للمركبات وجودة الصورة. وتعد عوامل مثل التعرض المفرط، والبهتان الضوئي (photobleaching)، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء، وجودة الخلايا، والمركبات المضافة، كلها عوامل يمكن أن تؤثر على النتائج وتتطلب اختباراً دقيقاً.

اضبط تحكم المسح بالنقر على "Scan" ضمن علامة التبويب "Acquire". ثم انقر على "Mode" لضبط حجم الإطار، وسرعة المسح، واتجاه المسح، ومتوسط المسح. انقر على "Channels" لضبط الثقب الضوئي (Pinhole)، والكسب والإزاحة (Gain and Offset)، وقوة الليزر.

احفظ هذه الإعدادات بالنقر على "Config" في علامة تبويب التكوين (Configuration) وقم بحفظها في قاعدة بيانات التكوين. اضبط التصوير بفاصل زمني بالنقر على "Muti TimeX" في علامة تبويب الماكرو (Macro). انقر على "Single Location".

قم بتطبيق الإعدادات المحفوظة بالنقر فوق "Single Track" ثم انتقل إلى الإعداد المطلوب في قاعدة بيانات الإعدادات (Configuration database). حدد الفاصل الزمني وعدد عمليات المسح. قم بتحميل الإعدادات بالنقر فوق "Load Conf".

قم بتسمية التصوير بفاصل زمني في "اسم الملف الأساسي" واختر قاعدة البيانات بالنقر فوق "قاعدة بيانات الصور" لحفظ التصوير بفاصل زمني. حدد مجلداً مؤقتاً بالنقر فوق "مجلد الصور المؤقت". بعد ذلك، افتح وحدة التحضين، وارفع حلقة التصوير، وأضف قطرة من زيت الغمر Immersion Oil إلى العدسة الشيئية، ثم أغلق الوحدة بأسرع ما يمكن. قم بضبط التركيز واختيار موضع في غرفة التصوير.

في خزانة التدفق الصفائحي، قم بتخفيف الدواء الحر أو الجسيمات النانوية بتركيز 5 µg/mL من الدواء أو 0.05 µmol من الدهون في وسط زراعة الخلايا. قم بالترشيح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.22 micron إذا لم يكن الدواء أو الجسيمات النانوية معقمة. افتح غرفة التحضين وارفع غطاء السقف.

بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من الخلايا، وأضف 1 mL من الدواء المخفف أو الجسيمات النانوية، ثم أغلق الوحدة بأسرع ما يمكن. قم بتركيز العدسة على الخلايا وأجرِ مسحاً سريعاً بالنقر على "Single" في علامة تبويب Scan Control. وعندما تظهر صورة المجال المضيء خلايا مركزة، ابدأ التصوير بفاصل زمني بالنقر على "Start Time" في Multi TimeX Macro.

يظهر عدد التكرارات والوقت المتبقي في الماكرو وفي الصور. تحقق بانتظام للتأكد من أن الخلايا لا تزال في بؤرة التركيز، أو استخدم خاصية التركيز التلقائي (Autofocus). يقوم البرنامج بحفظ التصوير الزمني (time-lapse) تلقائيًا في قاعدة البيانات.

لا تغلق قاعدة البيانات أثناء تشغيل البرنامج. هذا مقطع فيديو بنظام التصوير الزمني المستغرق (time-lapse) لمدة ثلاث ساعات لخلايا تعرضت لـ Doxorubicin الحر. لاحظ عملية الامتصاص والانتقال الفوري لـ Doxorubicin الفلوري الأحمر إلى النواة.

هنا، يتم تحضين الخلايا لمدة ثلاث ساعات مع الدوكسوروبيسين المغلف. تكون الإشارة الفلورية أقل بكثير وتقع في السيتوبلازم، بينما تكاد تكون الإشارة غير مرئية في النواة.

عند نقل هذه الأفلام ذات الفواصل الزمنية إلى برنامج Image J، يمكن رسم منطقة اهتمام حول النواة وقياس كثافة البكسل. يوضح الرسم البياني المعروض هنا الفرق في الامتصاص النووي بمرور الوقت في الخلايا التي تم تحضينها إما مع Doxorubicin الحر أو المغلف. تظهر هنا الخلايا التي تم تحضينها مع Doxorubicin المغلف، والموضحة باللون الأحمر.

تمثل الإشارة الأرجوانية الناقل، بينما صُبغت الجسيمات الحالة (Lysosomes) بعلامة خضراء للخلايا الحية. ويُظهر مقارنة كلا نوعي الخلايا اختلافاً في توزيع الجسيمات الحالة؛ حيث تتوزع الجسيمات الحالة في خلايا B16BL6 في جميع أنحاء السيتوبلازم.

بينما تقع الليزوزومات في خلايا BLM بالقرب من النواة، يُظهر كلا الخطين الخلويين تموضعاً مشتركاً عالياً للإشارتين الحمراء والأرجوانية في الليزوزومات، مما يشير إلى أن الدوكسوروبيسين وحامله محجوزان داخل هذه العضيات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير امتصاص العوامل العلاجية الكيميائية والعلامات الفلورية الأخرى في الخلايا الحية لعدة ساعات أو حتى أيام.