استخدام في المختبر خلية يعيش التصوير لاستكشاف تشريعات تسليمها بالقاعدة الدهنية جسيمات نانوية

الهدف العام من تقنية تصوير الخلايا الحية هذه هو متابعة العمليات الخلوية مثل امتصاص وتوزيع عوامل العلاج الكيميائي دون الحاجة إلى التثبيت. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال السرطان مثل: كيف يتم امتصاص العوامل الكيميائية سواء في شكل حر أو مغلفة في جزيئات نانوية بواسطة الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نصور الخلايا الحية ، وبالتالي نمنع القطع الأثرية للتثبيت والسماح بالتقييم الديناميكي في الوقت الفعلي.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا أن الأجزاء النانوية تتحلل أثناء التثبيت مما أدى إلى سوء تفسير توصيل الدواء. لتجميع غرفة التصوير ، ضع زجاجا مغطى مقاس 25 ملم في الجزء السفلي من الغرفة وقم بربط الجزء العلوي في الجزء السفلي. لا تشد بشدة ، حيث يمكن أن ينكسر الزجاج.

الأوتوكلاف الغرفة بأكملها. لطلاء الخلايا ، قم بإزالة حجرة التصوير من كيس التعقيم في خزانة التدفق الرقائقي. شد الحجرة بحذر وضعها في طبق بتري.

قم بتغطية زجاج غرفة التصوير بملليلتر واحد من الجيلاتين المعقم بنسبة 0.1 في المائة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بعد إزالة الوسط من قوارير زراعة الخلايا ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1x PBS وافصل الخلايا باستخدام 0.25 بالمائة من التربسين. قم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة وسيط زراعة الخلايا.

ثم اجمع الخلايا وقم بتدويرها عند 1،100 غرام لمدة خمس دقائق. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط زراعة الخلايا. بعد عد الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بشفط الجيلاتين وقم بوضع الخلايا في تخفيف يسمح بتغطية 70 بالمائة كحد أقصى في غضون 24 ساعة.

اسمح للخلايا بالالتصاق بنسبة خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. قم بإجراء تقييم للخلايا تحت المجهر بحثا عن التقاء وتشكل الخلايا والتلوث. ثم قم بتشغيل المجهر متحد البؤر وضوء الفلورسنت والكمبيوتر.

قم بتوصيل سخان العدسة بالهدف واضبطه على 35 درجة. قم بإعداد وحدة الحضانة كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع وحدة الحضانة على مرحلة المجهر وقم بتوصيل أنبوب ثاني أكسيد الكربون داخل وخارج.

افتح صمام ثاني أكسيد الكربون الرئيسي وقم بتشغيل وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون. تأكد من ضبط وحدة التحكم على خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. تعتبر ظروف زراعة الخلايا المناسبة مثل درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون ودرجة الحموضة والرطوبة والعقم ضرورية لتصوير الخلايا على المدى الطويل.

لذلك لكل حاضنة ، يجب اختبارها بشكل صحيح. اضبط درجة حرارة المسرح على 37 درجة مئوية. اسمح لوحدة الحضانة بالوصول إلى درجة الحرارة المحددة ونسبة ثاني أكسيد الكربون.

خذ غرفة التصوير من حاضنة ثاني أكسيد الكربون الرئيسية وانقل الغرفة في طبق بتري إلى غرفة الفحص المجهري. ضع حجرة التصوير في حامل مرحلة مصنوع حسب الطلب بقطر 35 ملم وأغلق الغرفة بغطاء مانع للتسرب حسب الطلب. افتح وحدة الحضانة ، واعمل بأسرع ما يمكن لمنع تبريد الخلايا ؛ استبدل الرقعة الحمراء بغرفة التصوير ثم أغلق الوحدة.

تأكد من عدم وجود كابلات عالقة بين المسرح والمجهر. اترك الوحدة لتتأقلم لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، افتح البرنامج وقم بتشغيل الليزر.

قم بإنشاء قاعدة بيانات جديدة بالنقر فوق جديد"ضمن علامة التبويب ملف. قم بتسمية قاعدة البيانات وحفظها. قم بتعيين التكوين بالنقر فوق Config "ضمن علامة التبويب Acquire.

حدد وضع القناة "و المسار الفردي" لتقييم فلوروفور واحد. حدد متعدد المسارات "للعديد من الفلوروفورات. بعد ذلك ، اختر مرشحات النطاق الماضي المناسبة ، مطابقة الفلوروفور.

حدد قناة المجال الساطع في أحد المسارات. يتم اختراق المسح بين إشارة الفلورسنت للمركبات وجودة الصورة. التعرض المفرط ، والتبييض الضوئي ، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء ، وجودة الخلايا ، والمركبات المضافة كلها عوامل يمكن أن تؤثر على النتائج وتحتاج إلى اختبارها بشكل صحيح.

قم بتعيين عنصر التحكم في الفحص بالنقر فوق "مسح" ضمن علامة التبويب Acquire. ثم انقر فوق الوضع "لتعيين حجم الإطار وسرعة المسح الضوئي واتجاه المسح ومتوسط المسح. انقر فوق القنوات"لضبط الثقب والكسب والإزاحة وقوة الليزر.

احفظ هذه الإعدادات بالنقر فوق Config"في علامة التبويب Configuration واحفظها في قاعدة بيانات التكوين. اضبط الفاصل الزمني بالنقر فوق Muti TimeX"في علامة التبويب Macro. انقر فوق موقع واحد.

قم بتطبيق التكوين المحفوظ بالنقر فوق مسار واحد"ثم قم بالتمرير إلى التكوين المطلوب في قاعدة بيانات التكوين. اضبط الفاصل الزمني وعدد عمليات الفحص. قم بتحميل التكوين بالنقر فوق تحميل المؤتمر.

قم بتسمية الفاصل الزمني في اسم الملف الأساسي وحدد قاعدة البيانات بالنقر فوق قاعدة بيانات الصورة "لحفظ الفاصل الزمني". قم بتعيين مجلد مؤقت بالنقر فوق مجلد الصور المؤقت" بعد ذلك ، افتح وحدة الحضانة ، وارفع حلقة التصوير ، وأضف قطرة من زيت الغمر إلى الهدف ، وأغلق الوحدة في أسرع وقت ممكن. التركيز وتحديد موضع في غرفة التصوير.

في خزانة التدفق الرقائقي ، قم بتخفيف الدواء الحر أو الجسيمات النانوية بتركيز خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الدواء أو 0.05 ميكرومول من الدهون في وسط زراعة الخلايا. قم بالتصفية من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون إذا لم يكن الدواء أو الجسيمات النانوية معقمة. افتح غرفة الحضانة وارفع غطاء السقف.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط من الخلايا ، وأضف ملليلتر واحد من الدواء المخفف أو الجسيمات النانوية ، وأغلق الوحدة في أسرع وقت ممكن. ركز على الخلايا وقم بإجراء فحص سريع بالنقر فوق فردي "في علامة التبويب Scan Control". عندما تظهر صورة الحقل الساطع الخلايا المركزة ، ابدأ الفاصل الزمني بالنقر فوق وقت البدء "في ماكرو Multi TimeX.

يتم عرض عدد مرات التكرار والوقت المتبقي في الماكرو وفي الصور. تحقق بانتظام لمعرفة ما إذا كانت الخلايا لا تزال في بؤرة التركيز ، أو استخدم التركيز البؤري التلقائي. يقوم البرنامج تلقائيا بحفظ الفاصل الزمني في قاعدة البيانات.

لا تغلق قاعدة البيانات أثناء تشغيل البرنامج. هذا هو الفاصل الزمني لمدة ثلاث ساعات من الخلايا المعرضة لدوكسوروبيسين الحر. لاحظ امتصاص دوكسوروبيسين الفلورسنت الأحمر وانتقاله الفوري إلى النواة.

هنا ، يتم تحضين الخلايا لمدة ثلاث ساعات باستخدام دوكسوروبيسين مغلف. إشارة الفلورسنت أقل بكثير وتقع في السيتوبلازم. بالكاد تكون الإشارة مرئية في النواة.

عند نقل أفلام الفاصل الزمني هذه إلى الصورة J ، يمكن رسم منطقة اهتمام حول النواة ويمكن قياس كثافة البكسل. يوضح الرسم البياني المقدم هنا الفرق في امتصاص الطاقة النووية بمرور الوقت في الخلايا المحتضنة إما بالدوكسوروبيسين الحر أو المغلف. كما هو موضح هنا ، هي خلايا محتضنة بدوكسوروبيسين مغلف ، كما هو موضح باللون الأحمر.

تمثل الإشارة الأرجواني الموجة الحاملة والليزوزومات ملطخة بعلامة خلية حية خضراء. تظهر مقارنة كلا النوعين من الخلايا اختلافا في التوزيع الليزوزومي. يتم توزيع الجسيمات الحالة في خلايا B16BL6 في جميع أنحاء السيتوبلازم.

في حين أن الجسيمات الحالة في خلايا BLM تقع بالقرب من النواة. ومع ذلك ، يظهر كلا الخطين الخليين توضعا عاليا للإشارة الحمراء والأرجوانية في الجسيمات الحالة مما يشير إلى أن دوكسوروبيسين وحامله محاصران في هذه العضيات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصوير امتصاص عوامل العلاج الكيميائي وعلامات الفلورسنت الأخرى في الخلايا الحية لعدة ساعات أو حتى أيام.