تحليل الجذعية الصرف في الأعمدة والطبقات

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحليل التوجيه الشجيري للخلايا العصبية ذبابة الفاكهة النخاعية البالغة في الأعمدة والطبقات لتوصيف أنماط التغصني ، وتحديد أنواع الخلايا بناء على التشكل ، وتحديد الطفر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، بما في ذلك رسم خرائط دوائر الدماغ ، وفهم آلية الأسلاك للتغصن. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تمرر الخصائص المتغصنة في الفضاء ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي تحسين فهم منطق الأسلاك المتغصنة ووظائفها.

الهدف من هذا الإجراء هو الحصول على مجموعتين من الصور من الخلايا العصبية ذات الأهمية في اتجاهين متعامدين وأفقيين وأماميين. باستخدام التقنيات القياسية ، قم بتشريح أدمغة الذباب مع الأرانب المضادة ل GFP والجسم المضاد الذي يصنف محاور المستقبلات الضوئية الأجسام المضادة الأولية. ثم قم بتسمية الأجسام المضادة الأولية بالأجسام المضادة الثانوية الفلورية وقم بتطهير الدماغ في 70٪ من الجلسرين و 1X PBS.

لتركيب الدماغ في الاتجاه الأفقي ، انقل الدماغ الذي تم تطهيره من الجلسرين إلى قطرة 20 ميكرولتر من وسط التركيب المضاد للبهتان المودع مركزيا على شريحة المجهر. ثم على غطاء ، قم بإرفاق بقع صغيرة من الطين في الزوايا الأربع لمنع الغطاء من سحق الدماغ. الآن تحت مجهر تشريح ، ضع الأدمغة في الوضع البطني لأعلى.

استخدم السطح الظهري المحدب للدماغ كمعلم لتحديد اتجاه عينة الدماغ. سيوفر هذا رؤية أفقية للخلايا العصبية. ثم قم بإرفاق الغطاء.

باستخدام مجهر متحد البؤر ، المجهز بشكل مثالي بكاشفات GaAsP ، احصل على مكدس صور العرض الأفقي بهدف فتحة عدمي عالية وتكبير رقمي يبلغ 2.5. احصل على ما لا يقل عن 180 قسما بصريا ، ولها 512 بكسل مربع ، وحجم خطوة 2 ميكرون. بعد التقاط مكدس الصور الأول ، قم بإزالة الغطاء من الشريحة وأعد وضع الدماغ في الوضع الأمامي لأعلى مما يوفر رؤية أمامية.

ثم باستخدام نفس التقنية ، قم بعمل مجموعة صور جديدة للعرض الأمامي لنفس الخلايا العصبية المصورة في العرض الأفقي. تأكد أيضا من تسجيل موقع الخلايا العصبية ذات الأهمية فيما يتعلق بالنخاع العصبي. تحديد نفس الخلايا العصبية ممكن في ظل تكبير أقل.

ومع ذلك ، إذا فقدت الإشارة لأن الأنسجة عميقة ، فما عليك سوى تصوير النصف البطني من دماغك. تحقق أيضا مما إذا كانت العينة قد تحركت أثناء الحصول على الصور من خلال فحص مكدسات الصور. تم تفصيل Image de convolution ودمج الصور في بروتوكول النص.

الهدف من هذا الإجراء هو تتبع الخلايا العصبية وتعيين نقاط مرجعية للتسجيل. افتح أولا ملف الصورة المعاد تجميعه. ثم انتقل إلى التحرير.

ثم إظهار ضبط العرض وإيقاف تشغيل قناة مستقبلات الضوء ، وهي حمراء. بعد ذلك ، تصور الصورة في وضع التجاوز. إذا كان الكمبيوتر مزودا بنظام مجسم ، فقم بتشغيل الاستريو واستخدم وضع المخزن المؤقت الرباعي لتصور الصور ثلاثية الأبعاد.

أضف خيوطا جديدة ، وانتقل إلى تجاوز ، ثم الخيوط ، وانقر على علامة التبويب المسماة تخطي الإنشاء التلقائي ، وقم بالتحرير يدويا. ثم انقر فوق علامة تبويب الرسم وحدد العمق التلقائي. بعد ذلك حدد الإعدادات.

قم بتبديل خيار الخط وأدخل رقم البكسل المناسب لتحسين المرئيات. ثم قم بتبديل إظهار التشعبات ونقطة البداية ونقطة التفرع ، واضبط جودة العرض على 100٪ الآن حدد علامة تبويب الرسم ، وابدأ في تتبع الأعصاب. ابدأ بالمحور العصبي ، ثم انتقل إلى التشعبات.

يجب أن يكون من السهل التمييز بين المحاور والتشعبات في الخلايا العصبية عبر النخاع. بعد تتبع الأعصاب ، ارجع إلى الإعدادات ، وقم بتبديل كل من نقطة البداية ونقطة التفرع. ثم انتقل إلى تجاوز ، ثم تصدير.

حدد الكائن، واحفظ الفتيل كملف مخترع. الخطوة التالية هي تعيين نقاط مرجعية. للبدء، حدد إظهار ضبط العرض وقم بتشغيل قناتي التصوير.

ثم انتقل إلى التجاوز ، ثم القياس. وضمن علامة التبويب "تحرير" ، قم بتبديل قناة معينة ، وحدد قناة مستقبلات الضوء في هذه الحالة. الآن قم بتعيين نقاط مرجعية للطبقة العليا.

حدد تجاوز ، ثم نقاط القياس ، وحدد بداية الطبقة m1 كطبقة عليا. استخدم وظيفة مستوى القطع لتسهيل تعيين النقاط. ترتيب النقاط هو الاستوائي ، الاستوائي الأمامي ، الأمامي ، البطني الأمامي ، البطني الخلفي ، الخلفي ، الاستوائي الخلفي ، والمركز.

للعثور على المستقبل الضوئي المركزي ، فهو المرتبط بأكثر العمليات التغصنية. بعد ذلك ، قم بتعيين النقاط المرجعية لطبقات R8 و R7 باستخدام نفس التقنية. بعد تحديد كل مجموعة من النقاط المرجعية ، قم بتصدير الإحداثيات.

حدد الإحصائيات، ثم القيم التفصيلية والمحددة والموضع. ثم حدد تصدير الإحصائيات في علامة التبويب عرض إلى ملف، واحفظ الإحداثيات كملف CSV. بعد ذلك ، افتح ملفات CSV الثلاثة في محرر جداول البيانات.

انسخ والصق إحداثيات النقاط المرجعية ال 27 في ملف جديد، باتباع ترتيب الأعلى وR8 ثم R7. تابع باتباع بروتوكول النص لتوحيد الجسم الصلب وتوحيد التسجيل غير الخطي TPS إلى التكوين البطني الأيمن في حساب التفرع الشجيري وترددات الإنهاء. في النهاية ، يتم استخدام البيانات لعمل مخططات إعلامية مختلفة. باستخدام إجراء التصوير ثنائي العرض المعروض هنا ، تم تصوير دماغ ذبابة يحتوي على خلايا عصبية TM 20 ذات علامات ضئيلة في اتجاهين متعامدين.

إعادة تركيب الصورة يحسن الدقة المحورية. تتمتع الصورة المعاد تجميعها بدقة أفضل من تلك الخاصة بصور العرض الأفقي والعرض الأمامي. بعد استشارة النماذج ثلاثية الأبعاد ، تم جمع الآثار المتغصنة من 15 TM 20 خلية عصبية ومقارنتها بآثار شجيرية من الخلايا العصبية 15 tm 2.

تم تحليل احتمالات التفرع والإنهاء لهذه الخلايا العصبية. كان كلا النوعين متشابهين للأجزاء التي يقل حجمها عن 4 ميكرون. أظهر التحليل الخاص بالطبقة للإنهاء الشجيري أن نوعي الخلايا العصبية يتوزعان بطرق محددة للطبقة.

تتلقى التشعبات Tm 2 مدخلات في m2 و m5. بينما تنتهي التشعبات tm 20 في طبقة m1 إلى m3. يظهر التحليل المستوي أن التشعبات tm 2 تظهر من الأمام ، بينما تبرز التشعبات tm 20 في الخلف.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الحصول على صورتين من صورتك متحد البؤر. اقرأ علامات الدراسة الخاصة بك على ملفات التصوير واستخرج الخصائص المتغصنة من هذه الصور. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم وضع علامة على العينة بشكل صحيح قبل التصوير متحد البؤر.

حيث ستفشل تركيبة التصوير إذا تحركت العينة أثناء التصوير.