استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

الهدف العام من هذه التجربة هو صنع جهاز موائع دقيقة متخصص واستخدامه لقياس العمر الافتراضي والأنماط الظاهرية الخلوية لخلية خميرة واحدة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال شيخوخة الخميرة ، مثل سبب تقدم الخلايا الأم في العمر وموت وما هي الأحداث الجزيئية السابقة التي تؤدي إلى فقدان التوازن الخلوي وفي النهاية شيخوخة الخلايا وموتها؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكننا تتبع الخلايا الأم ، وتتبع عمرها ، والعلامات الجزيئية المختلفة في نفس الوقت ، حتى نتمكن من البحث عن الأحداث الجزيئية التي ترتبط بالعمر الافتراضي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لشيخوخة الخميرة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على مجالات أخرى ، مثل مراقبة الاستجابات الثانوية للمشاركة التي تتطلب فحص الخلايا لأجيال عديدة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن تصنيع جهاز الموائع الدقيقة ، وتحميل الخلايا ، وإعداد المجهر يتطلب الكثير من الممارسة لأداء بنجاح. يعد العرض المسبق لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأنه من الصعب تحميل جهاز الموائع الدقيقة بالخميرة بشكل صحيح.

للبدء ، قم بتصنيع قالب رقاقة السيليكون للجهاز باستخدام التقنيات القياسية كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. ضعه في طبق بتري بطول 15 سم. قم بتأمين القالب على طبق بتري بالأشرطة.

بعد ذلك ، ضع قارب وزن نظيف على ميزان وقم بتمزيق الميزان. صب 50 جراما من قاعدة PDMS في قارب الوزن ثم أضف خمسة جرامات من عامل معالجة PDMS. حرك قاعدة PDMS وعامل المعالجة باستخدام ماصة يمكن التخلص منها.

ابدأ من حافة قارب الوزن وتحرك ببطء إلى الداخل. قلب الخليط جيدا لعدة دقائق حتى تتكون فقاعات صغيرة في جميع أنحاء الخليط. يسكب المزيج ببطء في طبق بتري ، بحيث يغطي قالب رقاقة السيليكون بالكامل.

ثم ضع طبق بتري في فراغ لمدة 10 دقائق لإزالة جميع فقاعات الهواء من خليط PDMS. إذا بقيت الفقاعات على سطح الخليط بمجرد إزالتها من الفراغ ، فاستخدم ماصة لتفجيرها. بعد ذلك ، اخبز الجهاز على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ساعتين.

عندما يتم تبريده مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بقص PDMS بعناية حول القالب ثم قم بتقشير طبقة PDMS المبلمرة برفق من قالب رقاقة السيليكون ، وتجنب أي ضرر لبناء قالب الرقاقة. ضع طبقة PDMS على المقعد بحيث يكون جانب النمط متجها لأعلى. قم بقص الشريحة الفردية بعناية بشفرة حلاقة صناعية ذات حافة واحدة ، مع الاحتفاظ بهامش مناسب من حافة كل شريحة لتجنب تلف البناء.

مع توجيه جانب النمط لأعلى ، استخدم قلم ثقب لعمل ثقوب مباشرة لأسفل من خلال دوائر المدخل والمخرج على كل جانب من القنوات. تحقق من كل ثقب عن طريق إدخال إبرة قلم الثقب مرة أخرى في الفتحة. تأكد من أن الإبرة يمكن أن تخرج من الجانب الآخر ، مما يشير إلى عدم وجود انسداد.

بعد ذلك ، استخدم الشريط لتنظيف جزيئات الغبار والحطام من السطح العلوي. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل ، واترك قطعة نظيفة من الشريط اللاصق على PDMS للحفاظ على سطح خال من الغبار. ثم اقلب الجهاز وكرر هذا الإجراء في الموقع المقابل لنظام إدارة البرمجيات (PDMS).

اترك آخر قطعة من الشريط على هذا الجانب أيضا. الآن قم بإعداد سطح زجاجي لقاعدة الجهاز. حدد قطعة الغطاء الزجاجية مقاس 24 ملم × 30 ملم بسماكة تتراوح بين 13 و 17 ملم.

رش 70٪ من الإيثانول على الزجاج ، وجففه بمزيل الغبار لتعقيم السطح. ثم انقل زجاج الغطاء و PDMS إلى لوحة بلاستيكية. قم بإزالة الشريط اللاصق من نظام إدارة المفاتيح ، وضع جانب النمط متجها لأعلى في اللوحة ، دون ملامسة السطح العلوي.

ثم انقل اللوحة إلى غرفة البلازما. قم بتطبيق معالجة بلازما الأكسجين على PDMS وزجاج الغطاء لجعل الأسطح محبة للماء. ثم قم بإزالة اللوحة من غرفة البلازما وقم بتوصيل الأسطح المعالجة بالبلازما بعناية من PDMS في غطاء زجاجي.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين نظام إدارة المباني السياحي وزجاج الغطاء. أخيرا ، انقل الجهاز إلى الفرن واخبزيه على حرارة 75 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل. اغمر أنابيب الإدخال والإخراج في محلول الإيثانول بنسبة 70٪ قبل يوم واحد من تحضير رقاقة PDMS.

في اليوم التالي ، املأ حقنة سعة خمسة ملليلتر بالماء المعقم ، واغسل كل أنبوب عن طريق وضع الأنبوب على المحقنة وغسل الأنبوب بالماء. كرر خطوة الغسيل ثلاث مرات على الأقل لإزالة الإيثانول المتبقي. بعد ذلك ، افحص قنوات PDMS تحت المجهر البصري.

باستخدام هدف 10 X ، تأكد من أن الهياكل متسقة وسليمة. قم بتثبيت شريحة PDMS السليمة على منصة المجهر باستخدام شريط سكوتش. قم بتأمين حقنة سعة خمسة ملليلتر محملة بالماء المعقم في مضخة حقنة وأدخل أنابيب الإدخال والإخراج المقابلة في الجهاز.

اضبط معدل التدفق على 750 ميكرولتر في الساعة واشطف الرقاقة لمدة 10 دقائق. راقب القنوات للتأكد من غسل أي فقاعات هواء. إذا بقيت أي فقاعات بعد 10 دقائق ، اشطفها يدويا ، اضبط السرعة للتخلص من الفقاعات.

انقل ملليلترا واحدا من عينة الخميرة المحضرة إلى أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 ملليلتر وقم بالطرد المركزي للعينات لمدة خمس دقائق عند 3 ، 000 مرة G. قم بإزالة غالبية المادة الطافية من كل أنبوب واجمع الباقي لتشكيل عينة سعة 5 ملليلتر. مع جاهزية عينة الخميرة الآن ، قم بإزالة أنابيب الإدخال من شريحة PDMS. اعكس مضخة الحقنة يدويا لامتصاص فقاعة هواء صغيرة يبلغ طولها سنتيمتريا إلى سنتيمترين ، كل أنبوب إدخال ، ثم امتصاص مزارع الخلايا.

ثم أدخل أنبوب الإدخال مرة أخرى في شريحة PDMS وأعد تشغيل المضخة لتحميل الخلايا بسرعة 750 ميكرولتر في الساعة. اترك مضخة الحقنة قيد التشغيل لمدة 10 دقائق ثم افحص تقدم تحميل الخلية تحت المجهر. سيؤدي التحميل الناجح إلى احتجاز الخلايا تحت أكثر من 60٪ من العمود المعلق.

للحفاظ على خلايا الخميرة ، قم بتبديل المحلول الموجود في المحقنة إلى محلول غذائي ، واضبط السرعة على 400 ميكرولتر في الساعة. يمكن الحصول على النمط الظاهري لعمر الخميرة عن طريق حساب عدد البراعم التي تنتجها كل خلية أم محاصرة ، وتقدير مقدر كابلان ماير. باستخدام هذا البروتوكول ، يحبس الجهاز بشكل متكرر الخلايا الوليدة الطازجة التي تنبثق عن الخلايا المحاصرة بالفعل.

ثم تتحول هذه الخلايا إلى خلايا أم جديدة يمكن التعرف عليها باستخدام برنامج تحليل الصور النهائي. توفر هذه الخلايا الأم الطازجة قياسا أكثر دقة للعمر. في هذه التجربة ، كان متوسط عمر الخلايا الأم الطازجة أطول قليلا بحوالي جيلين.

بالإضافة إلى عدد البراعم ، يمكن استخراج الفاصل الزمني بين حدثين متتاليين في التبرعم من بيانات التصوير. يتباطأ التبرعم بشكل كبير في نهاية عمرها الافتراضي مما يشير إلى الحالة غير الصحية لهذه الخلايا القديمة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام شريحة حديثة الصنع للمساعدة في تجنب الفقاعات ، وزيادة تركيز الخلية من أجل تحسين كفاءة تحميل الخلية عند الحاجة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال شيخوخة الخميرة لاستكشاف التغيرات الجزيئية المبكرة المسببة للنمط الظاهري للشيخوخة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع هذا الجهاز الموائع الدقيقة وكيفية استخدامه لقياس العمر الافتراضي والأنماط الظاهرية الخلوية في الخلايا المفردة.