استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

الهدف العام من هذه التجربة هو تصنيع جهاز مائعات دقيقة متخصص واستخدامه لقياس فترة الحياة والأنماط الظاهرية الخلوية لخلية خميرة واحدة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على بعض الأسئلة الرئيسية في مجال شيخوخة الخميرة، مثل سبب شيخوخة الخلايا الأم وموتها، وما هي الأحداث الجزيئية المبكرة التي تؤدي إلى فقدان التوازن الداخلي الخلوي وفي النهاية إلى شيخوخة الخلية وموتها؟ وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في قدرتنا على تتبع الخلايا الأم، ومتابعة فترة حياتها، ومختلف المؤشرات الجزيئية في آن واحد، مما يتيح لنا البحث عن الأحداث الجزيئية التي ترتبط بفترة الحياة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول شيخوخة الخميرة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في مجالات أخرى، مثل مراقبة الاستجابات الثانوية للمشاركة التي تتطلب فحص الخلايا عبر عدة أجيال. وبوجه عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن تصنيع الأجهزة الموائعية الدقيقة، وتحميل الخلايا، وإعداد المجهر تتطلب الكثير من الممارسة لأدائها بنجاح. ويعد العرض التوضيحي المسبق لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تحميل الجهاز الموائعي الدقيق بالخميرة بشكل صحيح.

للبدء، قم بتصنيع قالب من رقاقة السيليكون للجهاز باستخدام التقنيات القياسية الموضحة في البروتوكول النصي المرفق. ضع القالب بحيث يكون جانب الميزات للأعلى في طبق بتري سعة 15 سنتيمتر. قم بتثبيت القالب على طبق بتري باستخدام أشرطة لاصقة.

بعد ذلك، ضع وعاء وزن نظيف على الميزان ثم قم بتصفير الميزان. صب 50 grams من قاعدة PDMS في وعاء الوزن، ثم أضف خمسة grams من عامل معالجة PDMS. اخلط قاعدة PDMS وعامل المعالجة باستخدام ماصة ذات استخدام واحد.

ابدأ من حافة وعاء الوزن وتحرك ببطء نحو الداخل. قم بتقليب الخليط جيداً لعدة دقائق حتى تتشكل فقاعات صغيرة في جميع أنحاء الخليط. صب الخليط ببطء في طبق بيتري، بحيث يغطي قالب رقاقة السيليكون بالكامل.

بعد ذلك، ضع طبق بتري في جهاز تفريغ الهواء لمدة 10 دقائق لإزالة جميع الفقاعات الهوائية من خليط PDMS. إذا ظلت هناك فقاعات على سطح الخليط بعد إخراجه من جهاز التفريغ، فاستخدم ماصة لنفخها للخارج. بعد ذلك، قم بخبز الجهاز عند 75 °C لمدة ساعتين.

عندما تبرد العينة مرة أخرى إلى درجة حرارة الغرفة، اقطع بعناية مادة PDMS حول القالب، ثم انزع برفق طبقة PDMS الممبلمرة عن قالب رقاقة السيليكون، مع تجنب إلحاق أي ضرر بتركيبة قالب الرقاقة. ضع طبقة PDMS على المنضدة بحيث يكون جانب النمط متجهًا للأعلى. اقطع الشريحة الفردية بعناية باستخدام شفرة حلاقة صناعية ذات حافة واحدة، مع ترك هامش كافٍ من حافة كل شريحة مفردة لتجنب إتلاف التركيبة.

مع توجيه جانب النمط للأعلى، استخدم قلم ثقب لعمل ثقوب عمودية مباشرة عبر دوائر المداخل والمخارج على كل جانب من القنوات. تحقق من كل ثقب عن طريق إدخال إبرة قلم الثقب مرة أخرى في الثقب. تأكد من أن الإبرة يمكن أن تخرج من الجانب الآخر، مما يشير إلى عدم وجود انسدادات.

استخدم الشريط اللاصق بعد ذلك لتنظيف جزيئات الغبار والشوائب من السطح العلوي. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات على الأقل، واترك قطعة نظيفة من شريط Scotch اللاصق على الـ PDMS للحفاظ على السطح خاليًا من الغبار. ثم اقلب الجهاز وكرر هذا الإجراء على الجانب المقابل من الـ PDMS.

اترك القطعة الأخيرة من الشريط اللاصق على هذا الجانب أيضاً. الآن قم بتجهيز سطح زجاجي لقاعدة الجهاز. اختر قطعة من الزجاج الغطائي بمقاس 24 millimeter في 30 millimeter وبسمك يتراوح بين 13 و 17 millimeters.

رش الإيثانول بتركيز 70% على الزجاج، ثم جففه باستخدام مزيل الغبار لتعقيم السطح. بعد ذلك، انقل شريحة التغطية والـ PDMS إلى طبق بلاستيكي. قم بإزالة شريط Scotch من الـ PDMS، وضع جهة النمط للأعلى في الطبق، دون ملامسة السطح العلوي.

بعد ذلك، انقل الطبق إلى غرفة البلازما. قم بتطبيق معالجة بلازما الأكسجين على PDMS والزجاج الغطائي لجعل الأسطح محبة للماء. ثم أخرج الطبق من غرفة البلازما وقم بتوصيل الأسطح المعالجة بالبلازما من PDMS والزجاج الغطائي بعناية.

تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين الـ PDMS والزجاج الغطائي. أخيراً، انقل الجهاز إلى الفرن وقم بخبزه عند 75 °C لمدة ساعتين على الأقل. اغمر أنابيب الإدخال والإخراج في محلول ethanol بتركيز 70% قبل يوم واحد من تحضير شريحة الـ PDMS.

في اليوم التالي، املأ محقنة سعة 5 مل بالماء المعقم بجهاز الأوتوكلاف، واغسل كل أنبوب عن طريق وضع الأنبوب على المحقنة وشطفه بالماء. كرر خطوة الغسل ثلاث مرات على الأقل لإزالة بقايا الإيثانول. بعد ذلك، افحص قنوات PDMS تحت مجهر ضوئي.

باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 10X، تأكد من أن الهياكل متسقة وسليمة. قم بتثبيت شريحة PDMS السليمة على منصة المجهر باستخدام شريط لاصق. ثبّت محقنة سعة خمسة ملليلتر محملة بالماء المعقم في مضخة محاقن، ثم أدخل أنابيب الإدخال والإخراج المقابلة في الجهاز.

اضبط معدل التدفق على 750 µL/h واشطف الشريحة لمدة 10 دقائق تقريبًا. راقب القنوات للتأكد من جرف أي فقاعات هوائية. إذا ظلت هناك أي فقاعات بعد شطفها لمدة 10 دقائق، فقم بتعديل السرعة يدويًا لإزالة هذه الفقاعات.

انقل 1 mL من عينة خميرة محضرة إلى أنبوبي طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، ثم قم بطرد العينات مركزياً لمدة خمس دقائق عند 3,000 ×g. تخلص من معظم السائل العلوي من كل أنبوب واجمع المتبقي لتكوين عينة بحجم 5 mL. بعد أن تصبح عينة الخميرة جاهزة، قم بإزالة أنابيب الإدخال من شريحة PDMS. قم بعكس اتجاه مضخة السرنجة يدوياً لسحب فقاعة هواء صغيرة يتراوح طولها بين 1 و2 cm في كل أنبوب إدخال، ثم اسحب المزارع الخلوية.

بعد ذلك، قم بإدخال أنبوب الإدخال مرة أخرى في شريحة PDMS وأعد تشغيل المضخة لتحميل الخلايا بسرعة 750 microliters per hour. اترك مضخة الحقنة تعمل لمدة 10 دقائق، ثم افحص تقدم تحميل الخلايا تحت المجهر. يُعد التحميل ناجحاً عندما يتم احتجاز الخلايا تحت أكثر من 60% من الركائز المعلقة.

للحفاظ على خلايا الخميرة، استبدل المحلول الموجود في المحقنة بمحلول تغذية، واضبط السرعة على 400 µL في الساعة. ويمكن الحصول على النمط الظاهري لعمر الخميرة من خلال عدّ عدد البراعم التي تنتجها كل خلية أم محتجزة، وتقدير مقدر كابلان-ماير. وباستخدام هذا البروتوكول، يقوم الجهاز بشكل متكرر باحتجاز خلايا بنوية جديدة تبرعمت من الخلايا المحتجزة مسبقاً.

تتحول هذه الخلايا بعد ذلك إلى خلايا أم حديثة يمكن تحديدها باستخدام برنامج تحليل الصور اللاحق. وتوفر هذه الخلايا الأم الحديثة قياساً أكثر دقة لمدى الحياة. وفي هذه التجربة، كان متوسط مدى الحياة للخلايا الأم الحديثة أطول قليلاً بنحو جيلين.

بالإضافة إلى عدد البراعم، يمكن استخراج الفاصل الزمني بين حدثي تبرعم متتاليين من بيانات التصوير. يتباطأ التبرعم بشكل كبير نحو نهاية دورة حياة الخلايا، مما يشير إلى الحالة غير الصحية لهذه الخلايا الهرمة. وعند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام شريحة مُعدة حديثاً للمساعدة في تجنب الفقاعات، وزيادة تركيز الخلايا لتحسين كفاءة تحميل الخلايا عند الحاجة.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال شيخوخة الخميرة لاستكشاف التغيرات الجزيئية المبكرة المسببة لنمط الشيخوخة الظاهري. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع هذا الجهاز الموائع الدقيق وكيفية استخدامه لقياس مدى الحياة والأنماط الظاهرية الخلوية في الخلايا المفردة.