استخدام الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك β-lactamase المستندة إلى الكشف عن التفاعلات الجزيئية البيولوجية

الهدف العام من اختبار المستشعر الحيوي الموصلي هذا هو اكتشاف التفاعلات الجزيئية الحيوية ، باستخدام تقنية بيتا لاكتاماز الهجينة. نصف طريقة للكشف عن تفاعلات مستضد الأجسام المضادة ، باستخدام بروتين بيتا لاكتاماز خيمري. يعتمد مبدأ هذه الطريقة على اكتشاف الارتباط عن طريق قياس إطلاق البروتون لنشاط بيتا لاكتامازي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على أجهزة الاستشعار المناعية التقليدية هي استخدام بيتا لاكتاماز خيمري ، مما يجعل المقايسات الحسية أرخص وأسرع باستخدام بروتين هجين للكشف عن التحليلات ، ويوضح الإجراء ماثيو دونديلينجر ، وهو باحث دراسات عليا. ابدأ هذا الإجراء بعينة البروتين وتحضير المحلول كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإعداد القطب القابل لإعادة الاستخدام عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة سعة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من محلول تحضير القطب الكهربائي لمدة دقيقتين مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.

كرر هذه الخطوة ثلاث مرات. بعد ذلك ، اشطف الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من الماء المقطر لمدة دقيقتين مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة. لتجديد الأقطاب الكهربائية ، قم بغمس الأطراف في آبار صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من محلول التجديد بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية أو ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث غسلات من الأقطاب الكهربائية عن طريق غمس الأطراف في آبار من صفيحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات. قم بإجراء كل غسلة لمدة دقيقتين مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية الليزوزيم الأبيض للدجاجة على سطح البولي أنيلين للقطب عن طريق ترسيب قطرة 15 ميكرولتر من 40 ميكروغرام لكل مليلتر من HEWL المحضرة في مخزن مؤقت للفوسفات على سطح القطب.

احتضان القطب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإجراء ثلاث عمليات غسل للأقطاب الكهربائية باستخدام عازلة الفوسفات عن طريق غمس أجزاء القطب الكهربائي من رقائق المستشعر في بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من عازلة الفوسفات. قم بإجراء كل غسلة لمدة دقيقتين مع الخلط اللطيف في درجة حرارة الغرفة.

قم بتشبع الأقطاب الكهربائية عن طريق إضافة قطرة 30 ميكرولتر من محلول المانع على سطح القطب. احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل ثلاث مرات كما كان من قبل.

قم بتخفيف محاليل BlaP-cAb-Lys3 أو BlaP إلى 20 ميكروغرام لكل مليلتر في مخزن مؤقت ملزم. ثم ضع قطرة سعة 15 ميكرولتر من هذا المحلول المخفف على الأقطاب الكهربائية. احتضان الأقطاب الكهربائية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد تفاعل الجسم النانوي للمستضد ، اغسل الأقطاب الكهربائية ثلاث مرات بمحلول الغسيل. بعد ذلك ، اغسل أقطاب المستشعر في مخزن مؤقت للكشف عن طريق غمس الأقطاب الكهربائية في بئر من لوحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت للكشف. واحتضان لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة.

للكشف ، قم بتوصيل جهاز القياس الرقمي المتعدد بالكمبيوتر. بعد ذلك ، قم بتوصيل شريحة المستشعر بجهاز القياس الرقمي المتعدد عبر جزء الدوائر النحاسية. ابدأ استجابة المستشعر عن طريق تطبيق قطرة سعة 50 ميكرولتر من محلول بنزيل بنسيلين أربعة مللي مولار على الأقطاب الكهربائية ذات العلامات الموجبة.

ضع قطرة سعة 50 ميكرولتر من محلول الكشف على الأقطاب الكهربائية ذات العلامات السالبة لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي. راقب قيم الموصلية باستخدام جهاز القياس الرقمي المتعدد المتصل لمدة 30 دقيقة. تصور البيانات في الوقت الفعلي مباشرة على الشاشة ، أو قم بتصدير البيانات الرقمية كملف نصي.

يمكن رسم هذه البيانات الأولية من أجل إنشاء مخرجات رسومية تمثل قياسات تغيرات الموصلية بين الأقطاب المرجعية والعينة مع مرور الوقت. لبناء البروتين الخيمري ، تم استخدام الفئة A بيتا لاكتاماز BlaP كبروتين ناقل. هنا ، يتم تقديم المخلفات التحفيزية باللون الأحمر.

يشار إلى موقع الإدراج الموجود في حلقة مكشوفة بالمذيبات باللون الأصفر. تم إدخال جزء الجسم المضاد للإبل المسمى cAb-Lys3 في BlaP. البروتين الخيمري الناتج ، BlaP-cAb-Lyse3 ، قادر على ربط HEWL بينما يتم الاحتفاظ بنشاط بيتا لاكتامازي.

تم تثبيت HEWL على قطب كهربائي مشفر بالبولي أنيلين قبل تحميل BlaP-cAb-Lys3. يؤدي إطلاق البروتونات عند التحلل المائي للبنزيل البنسلين بواسطة البروتين الخيمري الثابت إلى تغييرات في الموصلية يمكن للمستخدم تفسيرها. تحتوي المستشعرات على ثماني رقائق منظمة على شكل أربعة أزواج.

تشتمل كل شريحة على ثلاثة أقطاب كهربائية ، وقطب كهربائي واحد مطلي بالبولي أنيلين ، وقطب مرجعي واحد ، وقطب مضاد واحد. لكل زوج ، تتوافق الشريحة المسماة سالبة مع عنصر تحكم سلبي ، في حين أن الشريحة المسماة إيجابية تتوافق مع العينة المختبرة. تظهر هنا قياسات التوصيل التي توضح التفاعل المحدد بين BlaP-cAb-Lys3 إلى HEWL.

تنتج تغيرات التوصيلية الكهربية عن إطلاق البروتون الناجم عن التحلل المائي للمضادات الحيوية بواسطة بيتا لاكتاماز الخيمري الثابت لا يمكن الكشف عن أي ارتباط للتحكم السلبي ، بيتا لاكتاماز الأصلي BlaP. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في 1/2 في اليوم إذا تم أداؤها بشكل صحيح وتم تحسين الظروف التجريبية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن إدخال جزء من الجسم المضاد في BlaP يمثل تحديا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة البيانات التي تم إنشاؤها ستعتمد على وظائف بيتا لاكتاماز الخيمري. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى تسمح بالقياس الكمي للتفاعل المكتشف من أجل تحديد ثابت ارتباط التوازن لهذا التفاعل.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المستشعر الحيوي المناعي لاستكشاف التفاعلات الجزيئية في عينات مختلفة تتراوح من الكائنات الحية إلى البيئات المختلفة. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو الكشف عن العديد من الجزيئات الحيوية نظرا لأن تقنية بيتا لاكتاماز الخيمرية هي أداة متعددة الاستخدامات لتشغيل أي جسم مضاد أو جزء من البروتين في التيار الكهربائي. لذلك ، يمكن استخدامه لتطوير أدوات تشخيصية رخيصة وسريعة في العديد من المجالات ، مثل صحة الإنسان.