تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد حاتمة (epitope) خطية للخلايا البائية يتم التعرف عليها بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة، وذلك باستخدام بروتينات مؤتلفة مقطوعة تسلسلياً ومسح ببتيدي عن طريق التهجين باللطخة النقطية (dot-blot hybridization). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بالتفاعل الجزيئي بين المستضد والجسم المضاد. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في بساطتها وكفاءتها.

ويمكن بعد ذلك استخدام الحاتمة المحددة في استقصاءات أكثر شمولاً، كما هو الحال في التطبيقات العلاجية والتشخيصية. وسيقوم بتوضيح هذا الإجراء Chien-Wen Chen، وهو باحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبري. للبدء، قم بزراعة خلايا الهجين أحادية النسيلة للفأر RGM56 في وسط هجين خالٍ من المصل.

يتم الحفاظ على المزارع الخلوية في دوارق T سعة 175 عند درجة حرارة 37 °C ونسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد خمسة أيام من الحضن، يُجمع وسط الزرع بعد أن يتحول لونه إلى الأصفر، ثم يُطرد السائل العلوي مركزياً بسرعة 4,500 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، يتم التخلص من الرواسب الخلوية للحصول على الأجسام المضادة في المحلول.

بعد ذلك، أضف 2 ml من ملاط البروتين G (protein G agro slurry) بتركيز 50% إلى عمود سعة 5 ml، وقم بموازنة الراتنج باستخدام 10 ml من محلول PBS البارد جداً، وهو ما يعادل 10 أحجام من الراتنج المُحمَّل مسبقاً. حمِّل 200 ml من محلول الأجسام المضادة الذي تم تحضيره مسبقاً على العمود الذي تمت موازنته، وتخلص من الجزء الذي يمر عبر العمود. اغسل العمود مرتين باستخدام 10 ml من محلول PBS البارد جداً.

أخيراً، لاستخلاص الأجسام المضادة من الراتنج، أضف 10 milliliters من محلول الجلسرين بمولارية millimolar عند pH 2.7 إلى العمود. اجمع كسوراً بحجم 900 microliter في أنابيب طرد مركزي دقيقة مملوءة مسبقاً بـ 100 microliters من محلول منظم معادلة 10X. خزّن الأجسام المضادة المنقاة في محلول glycerol بتركيز 50% مدعم بـ sodium azide عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

قم بتحضير البناءات الجينية وتحويل خلايا E.coli BL21 كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، انقل مستعمرة واحدة إلى أنبوب سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من مرق LB المضاف إليه 100 ميكروجرام لكل ملليلتر من الأمبيسيلين، وأغلق الأنبوب بشكل غير محكم. قم بحضن المزرعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الرج بسرعة 150 دورة في الدقيقة.

راقب الكثافة الضوئية للمستنبت عند 600 nanometers. وعندما تصل إلى حوالي 0.6، قم بتبريد المستنبت إلى 25 degrees Celsius. بعد ذلك، أضف IPTG بتركيز نهائي قدره 0.4 millimolar لتحفيز التعبير عن البروتين المؤتلف.

قم بتحضين المزرعة لمدة أربع ساعات أخرى عند 25 درجة Celsius مع الرج بسرعة 200 RPM. وبعد التحضين، انقل واحد ملليلتر من المزرعة البكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 12,000 ×g لمدة دقيقة واحدة وتخلص من الراشح.

قم بإعادة تعليق كتلة الخلايا في 100 µL من محلول التمسخ (denaturation buffer) عن طريق السحب والدفع باستخدام الماصة الدقيقة. ثم اخلط المعلق الناتج عن طريق الرج القوي بجهاز الفورتكس للحصول على عينة بروتين معاد التركيب جاهزة للاستخدام. وللمضي قدماً في التهجين بطريقة لطخة النقطة (dot-blot hybridization)، قم بإذابة كل ببتيد اصطناعي في DMSO للحصول على محاليل بتركيز 10 mg/mL.

بعد ذلك، قم بتنشيط غشاء PVDF في الميثانول لمدة دقيقتين، ثم قم بموازنته باستخدام محلول Towbin المنظم المعدل لمدة دقيقتين إضافيتين. اشطف قطعة من ورق الكروماتوغرافيا باستخدام محلول Towbin المنظم المعدل وضع غشاء PVDF الموازن فوقها. اترك الغشاء حتى يختفي المحلول المنظم من سطحه.

باستخدام رأس ماصة سعة 10 µL، أضف 2 µL من كل عينة ببتيد أو بروتين مؤتلف على الغشاء واتركه ليجف في الهواء لمدة 10 دقائق. تُعد عملية وضع العينات على الغشاء الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول؛ حيث يتطلب تحميل كمية دقيقة من العينة على مساحة صغيرة من غشاء PVDF اهتماماً دقيقاً.

بعد ذلك، يتم حجب الغشاء في محلول TBST المنظم المضاف إليه 5% حليب منزوع الدسم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الرج اللطيف. قم بتخفيف الجسم المضاد أحادي النسيلة RGM56 في محلول TBST المنظم المضاف إليه 5% حليب منزوع الدسم، ثم أضف محلول الجسم المضاد إلى الغشاء.

قم بتحضين الغشاء عند 37 °C لمدة ساعة واحدة مع الرج الخفيف. بعد التحضين، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة. ثم اغسل الغشاء مرتين في محلول TBST buffer لمدة خمس دقائق مع الرج الخفيف.

بعد ذلك، أضف إلى الغشاء محلول الجسم المضاد الثانوي المخفف في منظم TBST مع 5% حليب خالي الدسم. يتم تحضين الغشاء لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع الرج اللطيف. بعد التحضين، تخلص من محلول الجسم المضاد واغسل الغشاء في منظم TBST مرتين لمدة خمس دقائق مع الرج اللطيف.

بعد ذلك، يتم تحميض الغشاء باستخدام محلول المادة الركيزة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام. وعند ظهور الإشارة، يتم إيقاف التفاعل عن طريق غسل الغشاء بماء مقطر مرتين. وبعد تجفيف الغشاء في الهواء، يتم التقاط صورة لطبعة النقطة (dot-blot) باستخدام نظام تصوير.

وأخيراً، باستخدام برنامج تحليل الصور، قم بقياس شدة كل لطخة نقطية. يظهر هنا بروتين الكود الكامل لفيروس النخر العصبي الذي يتكون من الأحماض الأمينية من 1 إلى 338، بالإضافة إلى متغيراته المبتورة تسلسلياً. وللتأكد من تعبير البروتينات في الخلايا البكتيرية المحولة، تم إجراء تحليل اللطخة النقطية باستخدام جسم مضاد anti-6XHis، مما أظهر وجود جميع البروتينات قيد الدراسة.

بعد ذلك، تم تحليل البروتينات مأشوبة عن طريق تهجين لطخة النقطة (dot-blot hybridization) باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة RG-M56. وقد كشف التحليل أن الحاتمة البروتينية التي يتعرف عليها الجسم المضاد توجد في الببتيد من 195 إلى 338. وأخيرًا، تم تحديد حاتمة تتكون من 20 أو ثمانية بقايا من الأحماض الأمينية عن طريق المسح الببتيدي.

أظهر المسح بالألانين أن استبدال بقايا الفالين في الموضعين 197 و199 بالإضافة إلى السيستين في الموضع 201 قد أدى إلى إلغاء قدرة الحاتمة على الارتباط والتهجين في تحليل لطخة النقطة (dot-blot hybridization). وبالمثل، لوحظ انخفاض في ألفة الارتباط في تحليل شدة الارتباط، مما يؤكد أن البقايا المحددة ضرورية لارتباط الحاتمة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة RGM56. يمكن استخدام تقنية تحديد الببتيد هذه لتطوير أدوية ببتيدية علاجية أو مستحضرات طبية ببتيدية.