باستخدام أجهزة الاستشعار مقرها انزيم لقياس تونيك وطوري الغلوتامات في نماذج الماوس الزهايمر

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تغيرات الغلوتامات المنشطة والطورية خارج الخلية في الجسم الحي باستخدام مصفوفات MicroElectrode المرتبطة بالإنزيم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل ما إذا كانت مستويات الناقل العصبي خارج الخلية والديناميكيات السريعة لإطلاق الناقل العصبي وإزالته قد تغيرت في حالات المرض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن مصفوفات MicroElectrode يمكنها قياس تغيرات معينة في الناقلات العصبية داخل مناطق الدماغ المنفصلة ، مما يجعلها نهجا دقيقا مكانيا وزمانيا مع كونها طفيفة التوغل.

توضيح الإجراء هولي هونسبرغر وريان هيسلين من مختبري. لبدء هذا الإجراء ، قم بتغطية زوج من مواقع التسجيل على MEA بالإنزيم المطلوب وزوج مختلف من مواقع التسجيل بمصفوفة البروتين غير النشطة. بعد ذلك ، قم برسم أوكسيديز الغلوتامات أو مصفوفة البروتين باستخدام حقنة هاميلتون سعة 10 ميكرولتر.

اضغط برفق على المكبس لتوزيع حبة صغيرة من المحلول عند طرف المحقنة. لاستهداف مواقع تسجيل MEA ، تحت مجهر تشريح ، قم بتطبيق الحل على مواقع التسجيل المناسبة عن طريق الاتصال لفترة وجيزة بمواقع التسجيل باستخدام قطرة المحلول ، والتي تمثل طبقة واحدة. اضبط مؤقتا لمدة دقيقة واحدة بين تطبيقات الطلاء إلى مواقع التسجيل.

الآن ، ضع القطب المرجعي من خلال الفتحة الموجودة في الذراع البلاستيكي. اخفض القطب المرجعي في دورق يحتوي على PBS وتأكد من أنه لا يلامس الجزء السفلي من الدرق. بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب المرجعي بمرحلة الرأس وقم بتوصيل MEA ب mPD المطلي بمرحلة الرأس.

قم بخفض MEA في دورق المحلول بحيث يتم غمر طرف MEA فقط في المحلول. لا تغمر طرف منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا في سائل خارج الفقاعة السوداء. قد يؤدي القيام بذلك إلى إلحاق الضرر بمنطقة الشرق الأوسط وأفريقيا.

ثم حدد أيقونة الطلاء الكهربائي على سطح المكتب. في قائمة أداة الطلاء الكهربائي ، تحقق من إدخال الإعدادات الصحيحة. بعد ذلك ، حدد برنامج الخروج لإنهاء الطلاء الكهربائي.

اشطف أطراف القطب المطلي ب mPD بماء DI واحفظها لمدة 24 ساعة قبل المعايرة. في هذا الإجراء ، قم بتشغيل وسادة تسخين عند 37 درجة مئوية وقم بتوصيل مرحلة الرأس بنظام التحكم في التسجيل. ثم أدخل طرف MEA في 40 مل من 0.5 مولار PBS المخلص.

بعد ذلك ، قم بتوصيل القطب المرجعي بمرحلة الرأس. انقر فوق طرف القطب المرجعي للتأكد من عدم وجود فقاعات هواء. بعد ذلك ، افتح برنامج التسجيل ، وتأكد من صحة الإعدادات ، واختر رقم MEA ، وانقر فوق معايرة ، واضغط على ابدأ.

اترك من خمس إلى 10 دقائق للتوازن وابدأ المعايرة بمجرد استقرار خط الأساس. بعد ذلك ، حدد خط الأساس وأضف 500 ميكرولتر من حمض الأسكوربيك. بعد ذلك، حدد Interferencent بمجرد وصول التيار إلى هضبة ثابتة جديدة.

إذا تم طلاء MEA بالكهرباء بشكل صحيح ، فلا ينبغي ملاحظة أي تغيير. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولتر من 20 مللي مولار L-glutamate. بمجرد أن يصل التيار إلى هضبة ثابتة جديدة ، ضع علامة على الإضافة الأولى كمادة تحليلية.

كرر ثلاث مرات ليصبح المجموع ثلاث إضافات من الغلوتامات. ثم أضف 40 ميكرولتر من الدوبامين. وحدد مادة الاختبار.

بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولتر من البيروكسيد. حدد Test Substance وانقر فوق زر الإيقاف بمجرد انتهاء المعايرة. في هذه الخطوة، ضع الماصة الدقيقة في المنتصف بين جميع مواقع التسجيل البلاتينية الأربعة وقم بتثبيتها على ارتفاع 50 إلى 100 ميكرومتر فوق منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا باستخدام الشمع اللاصق وطين النمذجة.

باستخدام محول التيار المستمر ، قم بتثبيت السلك الموجب الأحمر بالسلك الفضي المحضر على جانب الدبوس الذهبي ، وقم بتثبيت السلك السالب الأسود بكاثود الحمام البلاتيني. بعد ذلك ، قم بتوصيل محول التيار المستمر وابحث عن عملية الطلاء الصحيحة. يجب أن تظهر الفقاعات في قطب الحمام ، ويجب أن يتحول القطب المرجعي إلى اللون الرمادي الفضي.

في هذا الإجراء ، ضع في الجهاز التجسيمي واستخدم قضبان الأذن لتثبيت رأسه. تأكد من تأمين وأن الرأس لا يتحرك. ثم ضعي مرهم العين باستخدام قضيب قطني معقم.

بعد ذلك ، حلق الرأس باستخدام ماكينة حلاقة. وقم بإزالة الفراء بالقرب من الأذنين باستخدام مقص جراحي صغير. بعد ذلك ، ضع اليود ثم الكحول على فروة الرأس ثلاث مرات بدلا من ذلك.

بعد ذلك ، قم بعمل شق في منتصف فروة الرأس وانشر الجلد. امتصاص أي دم بطرف قطني معقم واستخدم بيروكسيد الهيدروجين لتسهيل ظهور بريجما ولامدا. تأكد من وضع الرأس بشكل صحيح عن طريق قياس الظهر البطني والإنسي الجانبي للبريجما واللامدا.

اضبط الإحداثيات عند بريجما على الصفر وحدد الإحداثيات المستهدفة. بعد ذلك ، حفر حول العلامة. بعد ذلك ، قم بإرفاق MEA بمرحلة الرأس.

املأ الماصة بالمحلول الأول المطلوب. تأكد من ترك فجوة في الماصة بدون محلول حتى يمكن فحص المحلول الذي يتم طرده. ثم قم بتوصيل الأنبوب بالماصة الدقيقة الزجاجية.

ابحث عن بريجما مع إرفاق MEA واضبط الإحداثيات على الصفر. حرك MEA إلى الإحداثيات المطلوبة وخفض MEA ببطء حتى يلامس الطرف الدماغ. بعد ذلك ، قم بصفر الإحداثيات الظهرية البطنية ثم قم بخفض MEA ببطء في الدماغ.

ضع القطب المرجعي في مكان بعيد من منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا بحيث لا يزال على اتصال سائل مع الدماغ لإكمال الدائرة. في برنامج التسجيل ، انقر فوق القطب المعاير المطلوب ثم انقر فوق إجراء تجربة لبدء التسجيل. بعد الحصول على خط أساس ثابت ، اضبط قاذف الضغط على 0.6 ثانية و 0.5 رطل لكل بوصة مربعة واضغط على الزر الأحمر الموجود على قاذف الضغط للإخراج.

سجل الوقت والضغط بالإضافة إلى علامات الحجم المنقولة على ورقة الحقن وقم بتدوين أي ملاحظات إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، قم بإزالة MEA مع الماصة الدقيقة المرفقة ، واشطفها بماء DI ، وانقعها في PBS طوال الليل حتى يختفي كل الدم. في منطقتي CA3 و CA1 من الحصين ، زادت مستويات الغلوتامات المنشطة بشكل كبير في الفئران المعالجة TauP301L ، وهو تأثير تم تخفيفه بواسطة علاج الريلوزول.

هنا ، أظهر خط الأساس المطابق للتسجيلات التمثيلية لكلوريد البوتاسيوم الذي أثار إطلاق الغلوتامات في CA3 أن العلاج بالريلوزول خفف من الزيادة الكبيرة في سعة إطلاق الغلوتامات التي لوحظت في فئران Vehicle-TauP301L. أنتج التطبيق الموضعي لكلوريد البوتاسيوم زيادة قوية في الغلوتامات خارج الخلية التي عادت بسرعة إلى مستويات المنشط. أثارت الزيادة الملحوظة في كلوريد البوتاسيوم إطلاق الغلوتامات في DG و CA3 و CA1 التي لوحظت في الفئران TauP301L المعالجة بالمركبة بعد تخفيف التطبيق الموضعي لكلوريد البوتاسيوم بمعالجة الريلوزول.

يؤكد هذا القسم الملون باللون البنفسجي من الحصين موقع مسارات MEA في CA3 و CA1. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها المدرجة في المخطوطة. على سبيل المثال ، لتقليل الإشارات الصاخبة ، تذكر تأريض النظام واتباع الخطوات في الوقت المناسب.