What is the difference between forward and reverse genetic screens?

Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.

How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?

Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.

What are suppressor and enhancer screens used for?

Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.

How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?

In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.

What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?

Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.

How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?

Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.

How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?

Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.

الشاشات الجينية

0 مشاهدة08:50 دقيقة

الشاشات الجينية هي أدوات مهمة لتحديد الجينات والطفرات المسؤولة عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية ، ولفهم كيفية عمل الجينات في العمليات البيولوجية. يتم إجراء الشاشات في أنظمة نموذجية مختلفة ، بما في ذلك الذباب والديدان والنباتات وزراعة الخلايا ، وقد أدت إلى اكتشاف مسارات خلوية جديدة وأهداف دوائية محتملة للأمراض البشرية.

سيقدم هذا الفيديو نظرة عامة على الأنواع المختلفة من الشاشات الجينية ، ويشرح بروتوكولين عامين للشاشات في ديدان الديدان الخيطية ، ويوضح بعض الطرق التي يتم بها تطبيق الشاشات في المختبرات اليوم.

أولا ، دعنا نلقي نظرة على ماهية الشاشات الجينية وما يمكن أن نتعلمه منها.

تعتمد الشاشات الجينية على علم الوراثة الأمامي أو العكسي. في الشاشة الجينية الأمامية أو "الكلاسيكية" ، يتم إنشاء الطفرات بشكل عشوائي في الحمض النووي للكائن الحي باستخدام الإشعاع أو المواد الكيميائية المعروفة باسم الطفرات. يمكن أيضا إدخال قواعد إضافية في الحمض النووي باستخدام ، على سبيل المثال ، التسلسلات المعروفة باسم الينقولات ، والتي يمكن أن تتكامل في مواقع مختلفة داخل الجينوم وتعطل وظيفة الجينات التي يتم إدخالها فيها. غالبا ما تقترن هذه الأنواع من الإدخالات بمراسلي الفلورسنت لتمكين الكشف المباشر عن الكائنات الحية الطافرة. عندما يتم العثور على متحولة لعرض نمط ظاهري مثير للاهتمام ، يمكن بعد ذلك تعيين الجين غير المعروف الذي تم تحوره إلى كروموسوم وتسلسله.

النهج المعاكس للفحص هو الفحص الجيني العكسي ، حيث يعطل الباحثون التعبير عن العديد من الجينات المرشحة ، ثم يبحثون عن الأنماط الظاهرية الطافرة الناتجة عن هذه التلاعبات.

بالإضافة إلى طفرات "فقدان الوظيفة" التي تعطل نشاط الجين ، يمكن أن تستند الشاشات الجينية أيضا إلى طفرات "اكتساب الوظيفة" ، والتي تتسبب في زيادة تعبير الجين أو وظيفته. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إدخال العناصر التنظيمية للجينات بشكل عشوائي في الجينوم ، مما يؤدي إلى الإفراط في التعبير عن الجين الذي يدخله العنصر في المنبع.

بدلا من ذلك ، في طريقة تسمى "فحص التعبير" ، يستخدم الباحثون مكتبات البلازميدات التي تحتوي على تسلسل ترميز البروتين للجينات المختلفة ، ويدخلونها في الخلايا حيث سيتم التعبير عن الجينات بشكل كبير. يمكن بعد ذلك استخدام الأنماط الظاهرية الناتجة لفهم وظيفة الجينات.

للكشف عن مزيد من المعلومات حول جين أو طفرة معروفة ، يمكن استخدام شاشات المعدل. تبدأ الشاشة المثبطة بطفرة مميزة ، وتحدد طفرات إضافية تجعل النمط الظاهري المتحور أقل حدة. يشار إلى الطفرة المثبطة الموجودة في نفس الجين مثل الطفرة الأصلية باسم "داخل الجينت" ، في حين أن الطفرة المثبطة الموجودة في جين مختلف تعتبر "خارج المنشأ."

في المقابل ، تحدد شاشات المحسن طفرات إضافية تزيد من شدة النمط الظاهري المتحور. يمكن أن تكون هذه مفيدة في تحديد الجينات الزائدة عن الحاجة أو التي قد تتفاعل وظيفيا. إذا أدى الجمع بين طفرتين أو أكثر إلى ضعف شديد في النمو أو حتى الموت ، فإن الحالة تسمى "المرض الاصطناعي أو الفتاك". يكشف فحص الطفرات الاصطناعية المرضية أو المميتة عن الجينات التي تعمل في مسارات بيولوجية زائدة عن الحاجة ولكنها ضرورية. هذا مفيد بشكل خاص ، على سبيل المثال ، في تحديد منتجات جينية متعددة يمكن استهدافها في وقت واحد بالأدوية لقتل الخلايا السرطانية.

الآن بعد أن فهمت بعض استراتيجيات الفحص الجيني الشائعة ، دعنا نلقي نظرة على بروتوكول عام لشاشة أمامية في كائن حي نموذجي شائع ، وهو دودة الديدان الخيطية.

في هذا المثال ، سيتم إجراء الطفرات الكيميائية باستخدام إيثيل ميثان سولفونات أو EMS ، والذي يعمل عن طريق التعديل الكيميائي لنيوكليوتيدات الجوانين ، مما يتسبب في إقرانها بشكل غير لائق مع الثايمين في الجولات اللاحقة من تكرار الحمض النووي. نظرا لأن EMS هو مطفر ومسرطن محتمل ، يجب التعامل معه فقط عند ارتداء طبقة مزدوجة من القفازات ، ويجب أن يتم العمل في غطاء الدخان.

للبدء ، يتم اختيار أعداد كبيرة من الديدان في المرحلة الأخيرة من اليرقات وغسلها وجمعها. ثم يضاف EMS إلى الديدان ، ويتم تحضين الديدان لعدة ساعات لإحداث طفرات. بعد الطفرات ، يجب إزالة EMS من الديدان وتعطيلها بهيدروكسيد الصوديوم. ثم يتم غسل الديدان عدة مرات في وسط النمو وطلاءها على ألواح أجار.

بعد ذلك ، يتم نقل الديدان ذات المظهر الصحي إلى أطباق جديدة مبذرة بالبكتيريا كمصدر للغذاء ويسمح لها بالتكاثر. يمكن فحص ذرية الجيل الثاني بصريا بحثا عن الأنماط الظاهرية الطافرة ، مثل عيوب القاطرة.

الآن ، دعنا ننتقل إلى بروتوكول لفحص جيني عكسي في الديدان الخيطية.

تتمثل إحدى الطرق الشائعة لإجراء الشاشات العكسية في الديدان في إطعام مكتبة من البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة ، واحد لكل سلالة بكتيرية ، والتي ستقضي على التعبير عن جين مرشح واحد في الديدان. غالبا ما تكون هذه المكتبات متاحة تجاريا ، ويمكن ثقافتها الفرعية لاستخدامها في الشاشات.

للبدء ، يتم استزراع مستعمرات مفردة من البكتيريا التي تحتوي على نسخ مكتبات فردية ، ويتم تحفيز إنتاج الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة. ثم يتم رصد الثقافات على آبار منفصلة من صفيحة ذات وسط نمو الديدان الخيطية وتترك لتجف في غطاء دخان معقم.

بعد ذلك ، يتم طلاء الديدان على البكتيريا والسماح لها بالتغذية في غرفة رطبة لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. يمكن ملاحظة الأنماط الظاهرية الطافرة بسرعة ، إما في الديدان الأصلية الموضوعة على ألواح التغذية ، أو في ذرية الجيل الأول.

الآن بعد أن رأيت كيفية إجراء الشاشات الجينية الأمامية والعكسية ، دعنا نناقش بعض تطبيقاتها الحالية.

تستخدم بعض الشاشات الجينية لمساعدة العلماء على تحديد البروتينات التي تتفاعل جسديا أو تعمل في نفس المسار الجزيئي. في هذه التجربة ، ابتكر العلماء شاشة تعتمد على الفحص المجهري عالي الإنتاجية لاكتشاف مستقبلات غشاء جديدة تنشط جزيء إشارات معين. من خلال الإفراط في التعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات في خلايا الكلى الجنينية البشرية التي تحتوي على بروتين الإشارات الموسوم بالفلورسنت ، تمكنوا من مراقبة المستقبلات التي تؤثر على توطين البروتين تحت الخلوي.

تطبيق آخر للفحص الجيني هو توصيف التفاعلات الجينية والدوائية. هنا ، تم إنشاء مكتبة خميرة متحولة باستخدام طفرات عشوائية واسعة النطاق مع إدخالات الينقولات. ثم نمت كل سلالة متحولة في وجود دواء. تم قياس نمو كل سلالة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل متبوعا بمصفوفات دقيقة أو تحليل التسلسل لتحديد الطفرات ، مقارنة بالضوابط غير المتحولة ، التي كانت حساسة للعلاج الدوائي.

أخيرا ، يمكن استخدام الشاشات لفهم الجينات والشبكات الجزيئية التي تعطلت في الأمراض البشرية. قام الباحثون في هذه التجربة بزراعة الخلايا العصبية في وجود فيروسات ترميز الحمض النووي الريبي لتعطيل التعبير عن العديد من الجينات المستهدفة المختلفة. ثم تم استخدام التحليل الآلي للخلايا الملطخة بالمناعة للكشف عن الجينات التي تؤثر على الخصائص الفيزيائية للخلايا العصبية ، مثل نمو الخلايا العصبية. نجح هذا النهج في تحديد الجينات المشاركة في الأمراض التنكسية العصبية.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE على الشاشات الجينية - وهي تقنية قوية للكشف عن الجينات المشاركة في العمليات البيولوجية الرئيسية. في هذا الفيديو ، استعرضنا بعض الأنواع الرئيسية من الشاشات الجينية ، والبروتوكولات العامة لأداء كل من الشاشات الأمامية والخلفية ، وناقشنا كيفية تطبيق هذه الطرق في المختبرات اليوم. شكرا للمشاهدة!

الشاشات الجينية هي أدوات مهمة لتحديد وظيفة الجينات وفهم التفاعلات الجينية. تتضمن الشاشات عادة جينات متحولة ثم تقييم الكائنات الحية المصابة بحثا عن الأ…