تصنيع كسوات وناقل دقيق مستمد مصفوفة خارج الخلية حيث الثقافة خلية الأنسجة محددة ومنصات التوصيل

الهدف العام من هذا البروتوكول هو المساعدة في تحديد حجم الرغاوي أو الحوامل الدقيقة غير المترابطة كيميائياً والمشتقة من المادة الخلالية خارج الخلوية الخاصة بالأنسجة، وذلك لاستخدامها في تطبيقات نماذج المزارع الخلوية ثلاثية الأبعاد في المختبر، أو كسقالات محفزة للتجديد في أنظمة توصيل الخلايا. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجالات بيولوجيا الخلايا التطبيقية وهندسة الأنسجة، مثل كيفية قيام البيئة الخلوية الدقيقة ثلاثية الأبعاد بتنظيم وظائف الخلايا وتجديد الأنسجة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تصنيع سقالات ذات أشكال هندسية قابلة للضبط تحاكي تكوين المادة الخلالية خارج الخلوية الأصلية الخاصة بالأنسجة، وتكون مستقرة في المزارع طويلة الأمد دون الحاجة إلى ربط تشابكي إضافي.

بعد تجفيف المصفوفة خارج الخلوية (ECM) المشتقة من الأنسجة بالتجميد وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم مقصات جراحية حادة لفرم النسيج منزوع الخلايا فرمًا ناعمًا. ولطحن النسيج المعالج بالتجميد، املأ غرفة طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 25 milliliter خاصة بنظام طحن كروي مختبري بـ ECM المجففة بالتجميد والمفرومة، وأضف كرتي طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 10 milliliter. أغلق غرفة الطحن المملوءة واغمرها بالكامل في النيتروجين السائل لمدة ثلاث دقائق.

بعد ذلك، قم بطحن العينة المجمدة بتردد 30 Hertz لمدة ثلاث دقائق. كرر عملية الغمر في النيتروجين السائل والطحن حتى يتم طحن الـ ECM إلى مسحوق ناعم. زن 250 milligrams من الـ ECM المفروم أو المطحون بالتبريد وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter.

أضف خمسة ملليلتر من محلول NaH2PO4 المنظم بتركيز 22 molar إلى أنبوب الطرد المركزي وحدد مستوى السائل على الأنبوب. بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون من ألفا أميليز عن طريق إضافة 7.5 مليجرام من alpha amylase إلى ملليلتر واحد من محلول NaH2PO4 المنظم بتركيز 22 molar. تالياً، أضف 100 ميكرولتر من محلول alpha amylase المخزون إلى العينة.

ثم أضف NaH2PO4 بتركيز 22 مولار للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 milliliters. قم برج المعلق باستمرار بسرعة 300 RPM وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة. قم بطرد المعلق مركزياً عند 1500 ×g لمدة 10 دقائق.

اجمع السائل الطافي بعناية وتخلص منه دون تعكير راسب المصفوفة خارج الخلية (ECM) المهضوم. ثم استخدم 10 milliliters من NaCl بتركيز خمسة بالمائة مخفف في ماء مقطر مرتين لإعادة تعليق المادة المترسبة، مع التحريك المستمر لمدة 10 دقائق بسرعة 300 RPM. كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين قبل استخدام 10 milliliters من الماء المقطر مرتين لإعادة تعليق الراسب.

بعد ذلك، قم برج المعلق باستمرار بسرعة 300 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. وبعد طرد العينة مركزياً مرة أخرى، اجمع السائل الطافي بعناية وتخلص منه دون تعكير راسب الـ ECM المهضوم. أضف حمض الأسيتيك بتركيز 2 molar حتى علامة 5 ملليلتر.

ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس. بعد ذلك، استمر في تحريك المعلق بسرعة 120 RPM ودرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، وباستخدام مجانس يدوي مجهز بمسبار مسنن بعرض 10 مليمتر، قم بتجنيس معلق الـ ECM في درجة حرارة الغرفة على فترات زمنية مدتها 10 ثوانٍ حتى تختفي جميع الشظايا المرئية.

ضع المعلق في بيكر من الماء البارد بين فترات التجانس لمنع ارتفاع درجة الحرارة بشكل مفرط. قم بتحضين معلق ECM عند 37 درجة مئوية مع التقليب المستمر بسرعة 120 RPM حتى يسخن المعلق. بعد ذلك، استخدم حمض الأسيتيك بتركيز 2 molar لتخفيف معلق العينة إلى التركيز المطلوب.

باستخدام محقنة سعة 3 mL وإبرة قياس 18، املأ القالب المطلوب بمعلق ECM. يمكن تصنيع الرغوات بمجموعة متنوعة من الأشكال الهندسية اعتماداً على شكل القالب. قم بتغطية القوالب وتجميدها عند -20 أو -80 °C.

ثم ضع القوالب في دورق جهاز التجفيف بالتجميد. قم بتوصيل الدورق بنظام التجفيف بالتجميد المختبري وجفف القوالب لمدة 24 ساعة أو حتى تجف تماماً. قم بحضن معلق المصفوفة خارج الخلية (ECM) المطحونة بالتبريد مع التقليب المستمر بسرعة 100 RPM طوال الليل.

قم بتعبئة ثلاثة ملليلتر من معلق ECM في محقنة luer lock سعة ثلاثة ملليلتر، ثم قم بتوصيل مجموعة تسريب مجنحة بفتحة المحقنة. ثبت المحقنة داخل مضخة المحاقن. بعد ذلك، قم بتثبيت الإبرة على حامل ريتورت، وضع طرف الإبرة رأسيًا على مسافة تتراوح من أربعة إلى ستة سنتيمترات من أعلى قارورة ديوار ذات شكل منخفض.

بعد ذلك، قم بتثبيت قطب كهربائي بمشبك تمساح على طرف الإبرة، مع التأكد من توصيل مشبك التمساح بالطرف الموجب لمصدر الطاقة عالي الجهد. اقم بطي شريط من ورق الألمنيوم فوق حافة دورق التفريغ. ثم قم بتثبيت قطب كهربائي بمشبك تمساح ثانٍ على الحافة الخارجية لورق الألمنيوم.

قم بتوصيله بطرف التأريض في مصدر الطاقة. املأ دورق ديوار بالنيتروجين السائل حتى مسافة سنتيمتر واحد تقريباً من الأعلى، بحيث يتم غمر ثلاثة أرباع الرقاقة. بعد ذلك، اضبط مضخة المحقنة على معدل ضخ يبلغ 30 milliliters per hour وقم برش العينات كهربائياً وفقاً للبروتوكول المكتوب.

بمجرد اكتمال عملية التسريب، قم بسكب النيتروجين السائل الزائد من وعاء ديوار بعناية، مع ترك الحاملات الدقيقة معلقة في 25 milliliters تقريبًا من النيتروجين السائل لضمان بقائها مجمدة. انقل الحاملات الدقيقة مع النيتروجين السائل فورًا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter عن طريق السكب بحركة واحدة سلسة. بعد ذلك، استخدم ملعقة المختبر (Scoopula) لجمع أي حاملات دقيقة مجمدة متبقية في وعاء ديوار.

أضفهم إلى جهاز الطرد المركزي أيضاً. وللتحضير لعملية التجفيد، غطِّ أنبوب الطرد المركزي بورق ألومنيوم مثقوب بفتحات صغيرة. ثم ضع أنابيب الطرد المركزي المغطاة في قارورة جهاز التجفيد.

بعد ذلك، قم بتوصيل القارورة فوراً بجهاز التجفيف بالتجميد (lyophilizer) وجفف العينات طوال الليل. انقل الرغوة المجففة بالتجميد بلطف إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter يحتوي على فائض من الإيثانول المطلق. وبالمثل، أعد تعليق الحوامل الدقيقة المجففة بالتجميد في فائض من الإيثانول المطلق داخل أنبوب الطرد المركزي الأصلي المستخدم في عملية الجمع.

باستخدام ماصة سيرولوجية، قم بترشيح الحوامل الدقيقة عبر منخل من الفولاذ المقاوم للصدأ ذي حجم مسام محدد في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 milliliter لإزالة أي تجمعات واختيار نطاقات الحجم المطلوبة. قم بحضن العينة عند درجة حرارة أربع degrees Celsius لمدة أربع ساعات أو حتى تستقر الرغوة أو الحوامل الدقيقة في قاع أنبوب الطرد المركزي. بعد ذلك، وتحت غطاء تدفق صفائحي باستخدام تقنية معقمة، استخدم ماصة سيرولوجية لإزالة الإيثانول المطلق من السقالات وإضافة كمية فائضة من 95%ethanol مخفف بمحلول PBS معقم.

يتم تحضين السقالات عند درجة حرارة 4 °C لمدة أربع ساعات أو حتى تغوص السقالات إلى قاع وعاء إعادة الترطيب. يتم إعادة ترطيب السقالات تدريجياً من خلال سلسلة من الإيثانول. وفي كل خطوة، تُحضن السقالات عند درجة حرارة 4 °C حتى تغوص إلى قاع الوعاء، وذلك قبل تغيير المحلول.

استبدل محلول PBS المعقم بعمليتي شطف إضافيتين لإزالة بقايا الإيثانول. احفظ العينات في محلول PBS معقم بنسبة 100% عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى يحين وقت الزرع الخلوي. استخدم السقالات في غضون أسبوع إلى أسبوعين بعد عملية إعادة الترطيب.

تظهر هنا أمثلة على أنواع الرغاوي والحوامل الدقيقة المشتقة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) والمصنعة باستخدام الأنسجة الدهنية منزوعة الخلايا. بالإضافة إلى أنسجة الجلد الخنزيرية منزوعة الخلايا، والبطين الأيسر الخنزيري منزوع الخلايا. وهذا يثبت إمكانية تطبيق هذه التقنيات لإنتاج سقالات حيوية متخصصة لكل نسيج باستخدام مجموعة متنوعة من الأنسجة منزوعة الخلايا كمصادر للمصفوفة خارج الخلية.

بعد عملية الطحن بالتجميد أو التقطيع، والهضم الإنزيمي، والتجانس، يمكن توزيع العينات في وعاء قبل التجميد والتجفيد. يمثل هذا الشكل رغاوي DAT وDDT وDLV المطحونة بعد إعادة ترطيبها، والتي تم تخليقها في قالب طبق زراعة أنسجة يحتوي على 48 بئراً. وقد تم تصنيع رغاوي DAT وDDT وDLV هذه باستخدام ECM مطحون بالتجميد بتركيز 35 mg/mL ودرجة حرارة تجميد تبلغ -80 °C.

لتصنيع حاملات دقيقة مشتقة من المصفوفة خارج الخلوية (ECM) باستخدام تقنية الرش الكهربائي، يمكن ضبط تركيز معلق مصدر الـ ECM، وقطر الإبرة، ومعدل الضخ، والجهد الكهربائي لكل عينة، وذلك لإنتاج حاملات دقيقة كروية منفصلة يتراوح قطرها من 350 إلى 500 ميكرومتر بعد عملية إعادة ترطيب محكومة. وأخيرًا، تُظهر الحاملات الدقيقة من نوع DAT وDDT وDLV الموضحة هنا عبر المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) أن البنية الفائقة من حيث الحجم يمكن أن تختلف اعتمادًا على مصدر الـ ECM منزوعة الخلايا. يمكن استخدام الطرق المعروضة في هذا الفيديو لتصنيع مجموعة متنوعة من الحاملات الدقيقة والرغوات النوعية للأنسجة والمكونة من ECM نقية وغير مرتبطة كيميائيًا باستخدام الأنسجة منزوعة الخلايا كمصدر للمصفوفة.

بعد اتباع هذه الإجراءات، يمكن استزراع الخلايا على الرغاوي والحوامل الدقيقة في ظروف ساكنة أو ديناميكية، ويمكن استخدامها كركيزة توجيهية للخلايا في تطبيقات المزارع الخلوية المختبرية (invitro) والتطبيقات الحيوية داخل الجسم (invivo).