What is a single nucleotide polymorphism and why is it important in genetics?

A single nucleotide polymorphism (SNP) is a variation at a single DNA base that occurs throughout the genome. SNPs are the most common form of genetic variation in humans. While most SNPs do not alter protein structure or gene expression, they can be associated with diseases through linkage to disease-causing variants or by directly causing conditions like cystic fibrosis and sickle cell anemia.

How do SNP arrays work to identify genetic variants?

SNP arrays use short oligonucleotide probes chemically fixed to a glass slide biochip to identify individual SNPs directly. Hundreds of thousands of SNPs can be tested simultaneously. Isolated genomic DNA is amplified by PCR, fragmented, labeled with fluorescent markers, and hybridized to the chip. After washing away unbound DNA, fluorescent signals at each probe spot indicate the presence of target alleles.

What is the difference between allele-specific PCR and TaqMan PCR assays?

Allele-specific PCR uses primers designed to hybridize only to perfectly complementary SNP-containing sequences, with detection by fluorescent tags. TaqMan PCR uses SNP-specific probes containing both a fluorescent marker and a quencher molecule. During PCR, the polymerase's 5' exonuclease activity degrades only specifically bound probes, separating the fluorescent tag from the quencher and generating a detectable signal.

How do restriction fragment length polymorphism and primer extension assays detect SNPs?

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis exploits restriction endonucleases' specificity, where one allele is cleaved and the other is not, creating different fragment sizes. Primer extension assay uses primers binding one nucleotide short of the target SNP, then variably extends based on the allele present. Both methods generate fragments differentiated by gel electrophoresis, capillary electrophoresis, or mass spectrometry.

What are haplotypes and how do they simplify genome-wide association studies?

Haplotypes are groups of SNPs in linkage disequilibrium, meaning their variant combinations occur together more frequently than expected by chance, usually due to physical proximity on a chromosome. This allows researchers to differentiate haplotypes by genotyping only a small number of individual SNPs rather than testing all variants, making genome-wide association studies significantly less cost- and labor-intensive.

How can SNP genotyping distinguish between species varieties with similar appearances?

Genomic DNA is isolated and amplified using PCR primers designed to bind sequences with known SNPs or genetic variants specific to each variety. These primers only amplify DNA containing the specific polymorphism, allowing researchers to distinguish between look-alike varieties. This approach is also used to identify pathogenic bacteria harboring drug-resistance mutations in clinical settings.

Why is sequencing becoming increasingly important for SNP genotyping?

Sequencing can detect SNPs with high specificity and identify novel SNPs with unknown sequences, capabilities that other methods lack. As sequencing technologies become cheaper and more accessible, researchers increasingly use sequencing for genotyping. However, extra care and additional experimental replicates are necessary to distinguish actual SNPs from sequencing read errors during analysis.

التنميط الجيني SNP

0 مشاهدة08:23 دقيقة

يحدث التباين الجيني داخل وبين مجموعات سكانية مختلفة ، ويساهم في التباين في السمات ، بما في ذلك القابلية للإصابة بالأمراض ، بين الأفراد. الاختلافات الأكثر شيوعا هي تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو تعدد الأشكال ، يتضمن التنميط الجيني SNP تحديد مجموعات محددة من المتغيرات ، في هذه الحالة تعدد الأشكال ، الموجودة في الفرد.

سيناقش هذا الفيديو بعض المبادئ الكامنة وراء التنميط الجيني SNP ، ويقدم مقدمة للعديد من طرق تحديد SNP الشائعة ، وأخيرا ، بعض تطبيقات هذه التقنيات.

أولا ، دعنا نناقش ماهية SNP وكيف يمكن استخدامه في التنميط الجيني.

"تعدد الأشكال" هي أليلات ، أو إصدارات مختلفة من موضع جيني ، توجد بتردد ملحوظ داخل مجموعة سكانية ، وتشمل بدائل القاعدة بالإضافة إلى عمليات الإدخال أو الحذف. تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة هي اختلافات في قاعدة حمض نووي واحدة. يمكن أن تحدث تعدد الأشكال في جميع أنحاء الجينوم بأكمله ، ومعظمها لا يغير بنية البروتين أو التعبير الجيني. ومع ذلك ، قد لا تزال مرتبطة بالأمراض بسبب قربها الجسدي ، أو "ارتباطها" بمتغير جيني مسبب للأمراض. من ناحية أخرى ، هناك العديد من تعدد الأشكال البارزة المعروفة بأنها تسبب أمراضا مباشرة مثل التليف الكيسي وفقر الدم المنجلي والثلاسيميا β.

أحد التطبيقات العملية للتنميط الجيني SNP هو الطب الشخصي ، حيث قد يساعد تحديد تعدد الأشكال المرتبطة بالأمراض ، أو الاستجابات التفاضلية لدواء أو علاج ، الأطباء على تشخيص المرضى وعلاجهم بشكل أفضل.

تعتبر تعدد الأشكال مفيدة أيضا لدراسات الارتباط على مستوى الجينوم ، والتي تفحص مئات الآلاف من تعدد الأشكال عبر الجينوم بأكمله لتحديد تلك المرتبطة بالسمات أو الأمراض. يستفيد GWAS من مجموعات تعدد الأشكال المعروفة باسم "الأنماط الفردانية". تكون تعدد الأشكال داخل النمط الفرداني في "عدم توازن الارتباط" ، مما يعني أن مجموعة معينة من المتغيرات من المرجح أن تحدث معا أكثر مما كان متوقعا بالصدفة ، وغالبا ما يكون ذلك نتيجة لقربها الجسدي من الكروموسوم. هذا يعني أنه يمكن تمييز الأنماط الفردانية عن طريق التنميط الجيني فقط لعدد صغير من تعدد الأشكال الفردية ، مما يجعل دراسات الارتباط الجيني أقل تكلفة أو كثافة في العمالة.

بعد النظر في ماهية تعدد الأشكال وكيف يمكن استخدامها ، دعنا نستعرض العديد من المنهجيات العديدة التي تم تطويرها للنمط الجيني ل SNPs. وتشمل هذه التهجين المباشر ، والطرق القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل الأجزاء ، والتسلسل.

تستخدم تقنيات التهجين المباشر مثل مصفوفات SNP مجسات قليلة النوكليوتيدات القصيرة لتحديد تعدد الأشكال الفردية مباشرة. يمكن اختبار مئات الآلاف من تعدد الأشكال على شريحة حيوية واحدة. يتم تثبيت المجسات كيميائيا على مصفوفة الرقاقة ، وعادة ما تكون شريحة زجاجية. للكشف عن تعدد الأشكال في عينة ، يتم تضخيم الحمض النووي الجيني المعزول بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل وتجزئته لتحسين كفاءة ربط المسبار. ثم يتم تصنيف الحمض النووي ، عادة بعلامة الفلورسنت ، متبوعا بالتهجين إلى الشريحة. بعد السماح لعينة الحمض النووي بالارتباط بالمجسات ، يتم غسل كل الحمض النووي غير المرتبط أو غير المرتبط على وجه التحديد. من خلال قياس الإشارة في كل بقعة مسبار ، يمكن تحديد وجود الأليل المستهدف في العينة.

طريقة أخرى لكتابة SNP هي تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالأليل ، حيث يتم تصميم البادئات مقابل التسلسلات المحتوية على SNP بحيث يتم تهجينها فقط مع الأليل التكميلي تماما. يمكن اكتشاف منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل بطرق مثل علامات الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن تصميم بادئات PCR التي تحيط بموقع SNP محل الاهتمام جنبا إلى جنب مع مسبار خاص ب SNP ، كما هو الحال في مقايسة TaqMan PCR. هنا ، يحتوي المسبار على علامة فلورية ، بالإضافة إلى جزيء مروي يثبط التألق من العلامة القريبة. أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، سيتم تحلل تسلسل المسبار المرتبط على وجه التحديد فقط من خلال نشاط نوكلياز خارجي 5 للبوليميراز ، مما يفصل علامة الفلورسنت عن المروي وينتج عنه إشارة فلورية تشير إلى وجود متغير معين.

تتضمن الفئة الثالثة من الطرق ، تسمى تحليل الشظايا ، إنشاء شظايا الحمض النووي بأحجام أو ملصقات مختلفة ، بناء على وجود أو عدم وجود SNP معين. يستفيد تحليل تعدد أشكال طول جزء التقييد من الخصوصية الصارمة لنوكليازات التقييد لتسلسلاتها المستهدفة ، حيث يتم شق أليل واحد والآخر ليس كذلك. يستخدم مقايسة الربط مجسين يقعان بجوار بعضهما البعض مباشرة ، وينتهي أحدهما عند زوج الأساس المستهدف SNP. إذا كان المسبار المحتوي على SNP مرتبطا تماما ، يمكن أن يحدث الربط. يتضمن اختبار التمديد التمهيدي بادئات تربط نيوكليوتيدات واحدة أقل من SNP المستهدف. ثم يتم تمديد هذا التمهيدي بشكل متغير بناء على الأليل الفردي الموجود. يمكن بعد ذلك تمييز الشظايا الناتجة عن هذه الطرق باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي أو الشعيرات الدموية ، أو قياس الطيف الكتلي.

أخيرا ، يمكن أن يكتشف التسلسل تعدد الأشكال على وجه التحديد للغاية ، بالإضافة إلى تحديد تعدد الأشكال الجديدة ذات التسلسلات غير المعروفة. ومع ذلك ، يجب إجراء عناية إضافية وتكرارات تجريبية إضافية لتمييز تعدد الأشكال الفعلية عن أخطاء قراءة التسلسل. نظرا لأن تقنيات التسلسل أصبحت أرخص وأكثر سهولة ، يستخدم الباحثون بشكل متزايد التسلسل للتنميط الجيني.

بعد أن رأينا كيف يمكن تنميط تعدد الأشكال وراثيا ، دعنا نلقي نظرة على بعض التطبيقات المحددة لهذه التقنيات.

يمكن استخدام التنميط الجيني للتمييز بين أنواع الأنواع ذات المظهر المتطابق تقريبا. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الحمض النووي الجيني أولا ، متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات مصممة لربط التسلسلات مع تعدد الأشكال المعروفة أو المتغيرات الجينية الأخرى. ستعمل هذه البادئات فقط على تضخيم الحمض النووي للصنف الذي يحتوي على تعدد الأشكال المحدد ، وبالتالي يمكن استخدامها للتمييز بين هذه الأشكال المتشابهة.

يستخدم الباحثون أيضا التنميط الجيني لتحديد البكتيريا المسببة للأمراض التي تحتوي على طفرات محددة في مقاومة الأدوية. يتم إنشاء بروتوكول مصفوفة SNP مبسط للإعدادات منخفضة الموارد عن طريق إضافة الحمض النووي الجيني ومزيج PCR الرئيسي مباشرة إلى شريحة. يحدث تضخيم العينة وتهجينها في خطوة واحدة. ثم يتم غسل المصفوفات وتصويرها وتحليل النتائج لتحديد وجود أو عدم وجود بكتيريا السل ، بالإضافة إلى أي طفرات مقاومة للأدوية.

أخيرا ، يمكن استخدام تعدد الأشكال لتقييم وظيفة المتغيرات الجينية التي وجد أنها تزيد من مخاطر الإصابة بالمرض من خلال دراسات الارتباط. هنا ، جرب العلماء سلالة خلوية متغايرة الزيجوت ل "علامة" SNP محايدة تقع في الجزء المنسوخ من الجين ذي الأهمية ، بالإضافة إلى اختبار SNP غير المكتوب المرتبط بالمرض. يتم اختيار خط خلية تحكم سلبي متغاير الزيجوت لعلامة SNP ، ولكنه متماثل الزيجوت للمتغير غير المرتبط بالمرض لاختبار SNP. تم إجراء تمديد التمهيدي الخاص بالأليل على الحمض النووي الجيني ، بالإضافة إلى نسخ (كدنا) العكسي من mRNA المعبر عنه. ثم تم قياس كمية منتجات التمديد التمهيدي باستخدام قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF. من خلال مقارنة الوفرة النسبية للشظايا المرتبطة بأليلات SNP ، يمكن للباحثين تحديد ما إذا كان SNP المرتبط بالمرض يؤدي إلى انخفاض التعبير الجيني.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول التنميط الجيني SNP. قدم هذا الفيديو مفهوم واستخدامات تعدد الأشكال ، والعديد من الطرق الأساسية المستخدمة لتحديد وتوصيف تعدد الأشكال ، وسلط الضوء على ثلاثة تطبيقات للتنميط الجيني SNP. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

تعد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNPs ، الشكل الأكثر شيوعا للتباين الجيني لدى البشر. غالبا ما لا تؤثر هذه الاختلافات في القواعد الفردية في الحمض ا…