عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية المجمعات الجزيئية الكبيرة عن طريق تحليل الجسيمات المفردة لبيانات المجهر المجهري الإلكتروني باستخدام برنامج معالجة الصور SPHIRE. أصبحت cryo-EM أحادية الجسيمات تقنية سائدة لدراسة هياكل الجزيئات الكبيرة بدقة شبه ذرية. SPHIRE عبارة عن حزمة برامج جديدة تتيح المعالجة شبه الآلية لبيانات cryo-EM بطريقة سهلة الاستخدام.

الميزة الرئيسية مع SPHIRE هي آلية التحقق التلقائي. يجب تشغيل معظم الإجراءات مرة واحدة فقط ، وتكون النتائج موضوعية وقابلة للتكرار. يمكن استخدام cryo-EM عالي الدقة لوضع المخلفات الفردية ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة لتنظيم ووظيفة الآلات الجزيئية الدقيقة المعقدة.

يجب على الأفراد الجدد في هذه الطريقة أن يضعوا في اعتبارهم أن الحصول على هيكل عالي الدقة يعتمد بشكل كبير على جودة العينة وبيانات الإدخال. لبدء استخدام تطبيق SPHIRE، افتح واجهة المستخدم الرسومية من المحطة الطرفية. افتح الأدوات المساعدة لعرض صورة الفحص المجهري بالتبريد باستخدام e2display.

استخدم أداة القياس المدمجة لقياس أطول محور جسيمات في الأنغستروم لكل بكسل. افتح إعدادات المشروع. قم بتعيين حجم نافذة CTF على حجم مربع الجسيمات على الأقل.

اضبط حجم صندوق الجسيمات على رقم زوجي ، على الأقل 1 1/2 ضعف قطر الجسيمات. اضبط نصف قطر الجسيمات على نصف الطول المقاس على الأقل. أدخل تناظر مجموعة النقاط ، إذا كان معروفا ، والكتلة الجزيئية التقريبية.

سجل الإعدادات. بعد ذلك ، في قائمة MOVIE ، افتح محاذاة فيلم Micrograph. قم بتعيين مسارات الملفات القابلة للتنفيذ unblur و summovie.

اختر فيلم ميكروغراف أولي غير محاذاة، واستبدل متغير اسم الملف بحرف بدل لتعيين نمط مسار الرسم المجهري للإدخال. قم بتسمية دليل الإخراج. املأ عدد إطارات الأفلام وجهد المجهر والتعرض لكل إطار.

قم بتشغيل العملية لإنشاء صور مجهرية متوسطة مرجحة بالجرعة وغير مرجحة بالجعة. بعد ذلك ، افتح قائمة CTER ، وحدد تقدير CTF. اضبط الصور المجهرية غير المرجحة بالجرعة كمدخلات.

قم بتسمية دليل الإخراج ، واملأ معلمات جمع البيانات. اضبط أقل تردد على 0285 أنجستروم عكسي وأعلى تردد على 0.285 أنجستروم عكسي. قم بتشغيل العملية لإنشاء قائمة بمعلمات CTF.

بعد ذلك ، افتح قائمة WINDOW ، وحدد انتقاء الجسيمات. اضبط الصور المجهرية المرجحة بالجرعة كمدخل ، وابدأ الأداة المساعدة e2boxer. قم بإجراء انتقاء الجسيمات يدويا أو تلقائيا.

استخرج الجسيمات المنتقاة في مكدسات الصور، وادمج المكدسات في مكدس صور افتراضي واحد في قاعدة بيانات BDB. بمجرد انتقاء الجسيمات وتكديسها، افتح قائمة ISAC وحدد ISAC 2D Clustering. قم بتعيين مكدس الصور الظاهري في قاعدة بيانات BDB كإدخال.

تقدير عدد الصور لكل فئة. املأ المعلمات المتبقية، وقم بإنشاء متوسطات الفئة ثنائية الأبعاد. بمجرد اكتمال التصنيف ثنائي الأبعاد، استخدم الأداة المساعدة عرض البيانات لعرض متوسطات الفئات القابلة للتكرار التي تم التحقق من صحتها.

تحقق من تمثيل اتجاهات الجسيمات المتعددة وأن متوسطات الفئات ذات جودة مرضية. قم بإنشاء مكدس صور افتراضي جديد يحتوي فقط على جزيئات تنتمي إلى متوسطات الفئات التي تم التحقق من صحتها. بعد ذلك ، افتح قائمة VIPER ، واستخدم الأداة المساعدة عرض البيانات لعرض متوسطات الفئات.

احذف متوسطات الفئات ذات الجودة الرديئة أو تظهر طرق عرض متطابقة للجسيم. احفظ متوسطات الفئات المتبقية في ملف جديد. بعد ذلك ، حدد نموذج 3D الأولي RVIPER ، واستخدم الاختيار الصغير لمتوسطات الفئات كمدخل.

قم بتشغيل الأمر لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد أولي قابل للتكرار للبروتين. افحص النموذج في برنامج الرسومات الجزيئية Chimera. قارن النموذج بهيكل معروف لبروتين متماثل أو مجال من البروتين محل الاهتمام.

ارجع إلى قائمة VIPER في SPHIRE ، وحدد إنشاء مرجع ثلاثي الأبعاد. قم بإنشاء نموذج مرجعي ثلاثي الأبعاد أولي بحجم البكسل الصحيح وقناع ثلاثي الأبعاد. افتح قائمة MERIDIEN ، وحدد 3D Refinement.

املأ مكدس الصور المدخلة ومسارات الملفات المرجعية ثلاثية الأبعاد الأولية. قم بتسمية دليل الإخراج ، وقم بتعيين قناع النموذج المرجعي كقناع ثلاثي الأبعاد. حدد تطبيق قناع 2D الصلب.

اضبط دقة البداية على ما بين 20 و 25 أنجستروم ، وقم بتشغيل التحسين ثلاثي الأبعاد لإنتاج نصف وحدات التخزين غير المصفاة. ثم اعرض بنصف وحدة تخزين غير مفلترة في Chimera. حدد عتبة ثنائية ترتبط فيها جميع كثافات البروتين ولكن القطع الأثرية للضوضاء ليست كذلك.

ارجع إلى قائمة MERIDIEN الخاصة ب SPHIRE ، وافتح قناع 3D التكيفي. أدخل الإدخال نصف وحدة التخزين غير المصفاة وعتبة الثنائية. قم بتسمية قناع الإخراج ، وقم بتشغيل العملية لإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ذو حواف ناعمة.

بعد ذلك، افتح الشحذ، وحدد كلا من نصف وحدات التخزين غير المصفاة. اضبط قناع ثلاثي الأبعاد نصف الحجم الناعم كقناع يوفره المستخدم. قم بتشغيل العملية التي تدمج نصف وحدات التخزين ثم تقوم بتصفية وحدة التخزين المدمجة وزيادة حدتها.

افتح ملف السجل لعرض تقدير الدقة النهائي. قم بإنشاء خريطة ثلاثية الأبعاد للتوزيع الزاوي للجسيمات لمكدس صور الإدخال الذي تم إنشاؤه أثناء التحسين ثلاثي الأبعاد. افتح النموذج ثلاثي الأبعاد الحاد والمفلتر في Chimera.

افحص خريطة الكثافة وميزاته عالية الدقة. افتح التوزيع الزاوي في الوهم ، وتحقق من أن زوايا أويلر موزعة بشكل متناحي. افتح القائمة SORT3D، وحدد 3D Variability Estimation.

قم بإنشاء خريطة تباين ثلاثية الأبعاد من المكدس الافتراضي لصور الجسيمات التي تنتمي إلى متوسطات الفئات التي تم التحقق من صحتها. قم بإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ثنائي الأبعاد من خريطة التباين هذه للتجميع ثلاثي الأبعاد المركز اللاحق. بعد ذلك ، افتح 3D Clustering RSORT3D ، وحدد دليل التحسين ثلاثي الأبعاد السابق كمدخل.

قم بتسمية دليل الإخراج ، وقم بتعيين الأقنعة ثلاثية الأبعاد العالمية والمركزة. استخدم ما لا يقل عن 5,000 إلى 10,000 صورة لكل مجموعة لمجموعات البيانات الكبيرة. قم بتشغيل عملية الفرز لإنشاء وحدات تخزين لكل مجموعة ثلاثية الأبعاد متجانسة.

استخدم الوهم لتحديد الهيكل بأعلى دقة واضحة. ارجع إلى قائمة SORT3D في SPHIRE، وافتح Local Subset Refinement. قم بتعيين مسار ملف نص المجموعة الفرعية إلى ملف مجموعة معرف الجسيمات المقابل لبنية أعلى دقة.

قم بتعيين دليل التحسين ثلاثي الأبعاد إلى الدليل الذي يحتوي على نصف وحدات التخزين غير المصفاة وإعادة تشغيل التكرار إلى أعلى تكرار دقة من التحسين ثلاثي الأبعاد السابق. قم بتشغيل الأمر لإنشاء أنصاف وحدات تخزين محلية غير مصفاة. بعد ذلك ، قم بإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ذو حواف ناعمة من أحد نصف المجلدات المحلية.

دمج نصف وحدات التخزين المحلية، وزيادة حدة وحدة التخزين المدمجة دون تطبيق مرشح تمرير منخفض. بعد ذلك ، افتح قائمة LOCALRES ، وانقر فوق Local Resolution (الدقة المحلية). حدد نصف وحدات التخزين المحلية.

ثم حدد القناع المحلي ذو الحواف الرخوة. قم بتعيين الدقة الإجمالية على الدقة المطلقة المقدرة عند زيادة حدة الحجم المحلي المدمج. احسب الدقة المحلية لوحدة التخزين.

بعد ذلك ، افتح عامل التصفية المحلية ثلاثية الأبعاد. قم بتعيين وحدة التخزين المحلية الحادة غير المصفاة كمدخل. حدد خريطة الدقة المحلية والقناع ثلاثي الأبعاد ذو الحواف الناعمة.

قم بتطبيق مرشح الدقة المحلية على وحدة التخزين الحادة لإنتاج النموذج ثلاثي الأبعاد النهائي. افتح وحدة التخزين الناتجة وخريطة الدقة المحلية في Chimera. ابدأ تشغيل أداة Surface Color ، واختر مستوى الصوت من القائمة وخيار تلوين السطح وفقا للدقة المحلية.

تم تصوير مركب السموم TcdA1 بواسطة الفحص المجهري بالتبريد. أظهرت جميع الصور جسيمات مفردة يمكن تمييزها بوضوح وحلقات Thon تمتد إلى دقة أفضل من أربعة أنجستروم في طيف الطاقة. تم اختيار الجسيمات باستخدام e2boxer ثم تم استخراجها في مجموعة صور.

تم إنشاء متوسطات الفئات ثنائية الأبعاد عن طريق المحاذاة والتجميع المتكرر المستقر ، أو ISAC. تم استخدام متوسطات الفئات هذه لحساب نموذج ثلاثي الأبعاد قابل للتكرار باستخدام RVIPER. يتفق هذا النموذج بشكل جيد مع التركيب البلوري الذي تم حله مسبقا ل TcdA1.

التحسين ثلاثي الأبعاد التلقائي لهذا النموذج باستخدام MERIDIEN إلى إنشاء تحليل map. 3D التباين شبه الذري إلى المرونة الموضعية للمنطقة الطرفية N التي تحمل علامة الهيستيدين ، ومجالات ربط المستقبلات ، ومجال ربط TcB. تم إجراء حسابات الدقة المحلية.

تمت تصفية النموذج الحاد محليا وتم تطبيق مقياس ألوان يتوافق مع الدقة المحلية ، مما يدل على الاتفاق الطوبولوجي بين المناطق ذات التباين العالي والمناطق ذات الدقة المنخفضة. أظهر الهيكل النهائي للتبريد الكهرومغناطيسي بدقة 3.5 أنغستروم ل TcdA1 كثافات واضحة لمعظم السلاسل الجانبية. يمكن استخدام خريطة الكثافة بهذا المستوى من التفاصيل لبناء النموذج الذري من جديد.

باستخدام هذا النهج ، يمكن الحصول على هيكل دقة شبه ذري في غضون ساعات أو بضعة أيام ، دون معلومات هيكلية مسبقة. أثناء محاولة هذا الإجراء، استخدم فقط بيانات عالية الجودة وتحقق من النتائج الوسيطة. قد يكون عدم التجانس التركيبي والهيكلي لعينة cryo-EM عاملا مقيدا للوصول إلى دقة شبه ذرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام SPHIRE للتحديد الهيكلي للتبريد. كما رأيت ، فإن إجراءات التجميع المضمنة في SPHIRE ستسمح لك ليس فقط بحل بنية البروتين محل الاهتمام ، ولكن أيضا لدراسة الديناميكيات التوافقية وتوفير نظرة ميكانيكية حاسمة للآليات الجزيئية المعقدة.