عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير
May 16th, 2017
تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة الصور البرد إم باستخدام مجموعة البرامج سفير. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على ما يقرب من جميع المشاريع إم الجسيمات واحد التي تستهدف قرار شبه الذرية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية المجمعات الجزيئية الكبيرة عن طريق تحليل الجسيمات المفردة لبيانات المجهر المجهري الإلكتروني باستخدام برنامج معالجة الصور SPHIRE. أصبحت cryo-EM أحادية الجسيمات تقنية سائدة لدراسة هياكل الجزيئات الكبيرة بدقة شبه ذرية. SPHIRE عبارة عن حزمة برامج جديدة تتيح المعالجة شبه الآلية لبيانات cryo-EM بطريقة سهلة الاستخدام.
الميزة الرئيسية مع SPHIRE هي آلية التحقق التلقائي. يجب تشغيل معظم الإجراءات مرة واحدة فقط ، وتكون النتائج موضوعية وقابلة للتكرار. يمكن استخدام cryo-EM عالي الدقة لوضع المخلفات الفردية ، وبالتالي توفير نظرة ثاقبة لتنظيم ووظيفة الآلات الجزيئية الدقيقة المعقدة.
يجب على الأفراد الجدد في هذه الطريقة أن يضعوا في اعتبارهم أن الحصول على هيكل عالي الدقة يعتمد بشكل كبير على جودة العينة وبيانات الإدخال. لبدء استخدام تطبيق SPHIRE، افتح واجهة المستخدم الرسومية من المحطة الطرفية. افتح الأدوات المساعدة لعرض صورة الفحص المجهري بالتبريد باستخدام e2display.
استخدم أداة القياس المدمجة لقياس أطول محور جسيمات في الأنغستروم لكل بكسل. افتح إعدادات المشروع. قم بتعيين حجم نافذة CTF على حجم مربع الجسيمات على الأقل.
اضبط حجم صندوق الجسيمات على رقم زوجي ، على الأقل 1 1/2 ضعف قطر الجسيمات. اضبط نصف قطر الجسيمات على نصف الطول المقاس على الأقل. أدخل تناظر مجموعة النقاط ، إذا كان معروفا ، والكتلة الجزيئية التقريبية.
سجل الإعدادات. بعد ذلك ، في قائمة MOVIE ، افتح محاذاة فيلم Micrograph. قم بتعيين مسارات الملفات القابلة للتنفيذ unblur و summovie.
اختر فيلم ميكروغراف أولي غير محاذاة، واستبدل متغير اسم الملف بحرف بدل لتعيين نمط مسار الرسم المجهري للإدخال. قم بتسمية دليل الإخراج. املأ عدد إطارات الأفلام وجهد المجهر والتعرض لكل إطار.
قم بتشغيل العملية لإنشاء صور مجهرية متوسطة مرجحة بالجرعة وغير مرجحة بالجعة. بعد ذلك ، افتح قائمة CTER ، وحدد تقدير CTF. اضبط الصور المجهرية غير المرجحة بالجرعة كمدخلات.
قم بتسمية دليل الإخراج ، واملأ معلمات جمع البيانات. اضبط أقل تردد على 0285 أنجستروم عكسي وأعلى تردد على 0.285 أنجستروم عكسي. قم بتشغيل العملية لإنشاء قائمة بمعلمات CTF.
بعد ذلك ، افتح قائمة WINDOW ، وحدد انتقاء الجسيمات. اضبط الصور المجهرية المرجحة بالجرعة كمدخل ، وابدأ الأداة المساعدة e2boxer. قم بإجراء انتقاء الجسيمات يدويا أو تلقائيا.
استخرج الجسيمات المنتقاة في مكدسات الصور، وادمج المكدسات في مكدس صور افتراضي واحد في قاعدة بيانات BDB. بمجرد انتقاء الجسيمات وتكديسها، افتح قائمة ISAC وحدد ISAC 2D Clustering. قم بتعيين مكدس الصور الظاهري في قاعدة بيانات BDB كإدخال.
تقدير عدد الصور لكل فئة. املأ المعلمات المتبقية، وقم بإنشاء متوسطات الفئة ثنائية الأبعاد. بمجرد اكتمال التصنيف ثنائي الأبعاد، استخدم الأداة المساعدة عرض البيانات لعرض متوسطات الفئات القابلة للتكرار التي تم التحقق من صحتها.
تحقق من تمثيل اتجاهات الجسيمات المتعددة وأن متوسطات الفئات ذات جودة مرضية. قم بإنشاء مكدس صور افتراضي جديد يحتوي فقط على جزيئات تنتمي إلى متوسطات الفئات التي تم التحقق من صحتها. بعد ذلك ، افتح قائمة VIPER ، واستخدم الأداة المساعدة عرض البيانات لعرض متوسطات الفئات.
احذف متوسطات الفئات ذات الجودة الرديئة أو تظهر طرق عرض متطابقة للجسيم. احفظ متوسطات الفئات المتبقية في ملف جديد. بعد ذلك ، حدد نموذج 3D الأولي RVIPER ، واستخدم الاختيار الصغير لمتوسطات الفئات كمدخل.
قم بتشغيل الأمر لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد أولي قابل للتكرار للبروتين. افحص النموذج في برنامج الرسومات الجزيئية Chimera. قارن النموذج بهيكل معروف لبروتين متماثل أو مجال من البروتين محل الاهتمام.
ارجع إلى قائمة VIPER في SPHIRE ، وحدد إنشاء مرجع ثلاثي الأبعاد. قم بإنشاء نموذج مرجعي ثلاثي الأبعاد أولي بحجم البكسل الصحيح وقناع ثلاثي الأبعاد. افتح قائمة MERIDIEN ، وحدد 3D Refinement.
املأ مكدس الصور المدخلة ومسارات الملفات المرجعية ثلاثية الأبعاد الأولية. قم بتسمية دليل الإخراج ، وقم بتعيين قناع النموذج المرجعي كقناع ثلاثي الأبعاد. حدد تطبيق قناع 2D الصلب.
اضبط دقة البداية على ما بين 20 و 25 أنجستروم ، وقم بتشغيل التحسين ثلاثي الأبعاد لإنتاج نصف وحدات التخزين غير المصفاة. ثم اعرض بنصف وحدة تخزين غير مفلترة في Chimera. حدد عتبة ثنائية ترتبط فيها جميع كثافات البروتين ولكن القطع الأثرية للضوضاء ليست كذلك.
ارجع إلى قائمة MERIDIEN الخاصة ب SPHIRE ، وافتح قناع 3D التكيفي. أدخل الإدخال نصف وحدة التخزين غير المصفاة وعتبة الثنائية. قم بتسمية قناع الإخراج ، وقم بتشغيل العملية لإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ذو حواف ناعمة.
بعد ذلك، افتح الشحذ، وحدد كلا من نصف وحدات التخزين غير المصفاة. اضبط قناع ثلاثي الأبعاد نصف الحجم الناعم كقناع يوفره المستخدم. قم بتشغيل العملية التي تدمج نصف وحدات التخزين ثم تقوم بتصفية وحدة التخزين المدمجة وزيادة حدتها.
افتح ملف السجل لعرض تقدير الدقة النهائي. قم بإنشاء خريطة ثلاثية الأبعاد للتوزيع الزاوي للجسيمات لمكدس صور الإدخال الذي تم إنشاؤه أثناء التحسين ثلاثي الأبعاد. افتح النموذج ثلاثي الأبعاد الحاد والمفلتر في Chimera.
افحص خريطة الكثافة وميزاته عالية الدقة. افتح التوزيع الزاوي في الوهم ، وتحقق من أن زوايا أويلر موزعة بشكل متناحي. افتح القائمة SORT3D، وحدد 3D Variability Estimation.
قم بإنشاء خريطة تباين ثلاثية الأبعاد من المكدس الافتراضي لصور الجسيمات التي تنتمي إلى متوسطات الفئات التي تم التحقق من صحتها. قم بإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ثنائي الأبعاد من خريطة التباين هذه للتجميع ثلاثي الأبعاد المركز اللاحق. بعد ذلك ، افتح 3D Clustering RSORT3D ، وحدد دليل التحسين ثلاثي الأبعاد السابق كمدخل.
قم بتسمية دليل الإخراج ، وقم بتعيين الأقنعة ثلاثية الأبعاد العالمية والمركزة. استخدم ما لا يقل عن 5,000 إلى 10,000 صورة لكل مجموعة لمجموعات البيانات الكبيرة. قم بتشغيل عملية الفرز لإنشاء وحدات تخزين لكل مجموعة ثلاثية الأبعاد متجانسة.
استخدم الوهم لتحديد الهيكل بأعلى دقة واضحة. ارجع إلى قائمة SORT3D في SPHIRE، وافتح Local Subset Refinement. قم بتعيين مسار ملف نص المجموعة الفرعية إلى ملف مجموعة معرف الجسيمات المقابل لبنية أعلى دقة.
قم بتعيين دليل التحسين ثلاثي الأبعاد إلى الدليل الذي يحتوي على نصف وحدات التخزين غير المصفاة وإعادة تشغيل التكرار إلى أعلى تكرار دقة من التحسين ثلاثي الأبعاد السابق. قم بتشغيل الأمر لإنشاء أنصاف وحدات تخزين محلية غير مصفاة. بعد ذلك ، قم بإنشاء قناع ثلاثي الأبعاد ذو حواف ناعمة من أحد نصف المجلدات المحلية.
دمج نصف وحدات التخزين المحلية، وزيادة حدة وحدة التخزين المدمجة دون تطبيق مرشح تمرير منخفض. بعد ذلك ، افتح قائمة LOCALRES ، وانقر فوق Local Resolution (الدقة المحلية). حدد نصف وحدات التخزين المحلية.
ثم حدد القناع المحلي ذو الحواف الرخوة. قم بتعيين الدقة الإجمالية على الدقة المطلقة المقدرة عند زيادة حدة الحجم المحلي المدمج. احسب الدقة المحلية لوحدة التخزين.
بعد ذلك ، افتح عامل التصفية المحلية ثلاثية الأبعاد. قم بتعيين وحدة التخزين المحلية الحادة غير المصفاة كمدخل. حدد خريطة الدقة المحلية والقناع ثلاثي الأبعاد ذو الحواف الناعمة.
قم بتطبيق مرشح الدقة المحلية على وحدة التخزين الحادة لإنتاج النموذج ثلاثي الأبعاد النهائي. افتح وحدة التخزين الناتجة وخريطة الدقة المحلية في Chimera. ابدأ تشغيل أداة Surface Color ، واختر مستوى الصوت من القائمة وخيار تلوين السطح وفقا للدقة المحلية.
تم تصوير مركب السموم TcdA1 بواسطة الفحص المجهري بالتبريد. أظهرت جميع الصور جسيمات مفردة يمكن تمييزها بوضوح وحلقات Thon تمتد إلى دقة أفضل من أربعة أنجستروم في طيف الطاقة. تم اختيار الجسيمات باستخدام e2boxer ثم تم استخراجها في مجموعة صور.
تم إنشاء متوسطات الفئات ثنائية الأبعاد عن طريق المحاذاة والتجميع المتكرر المستقر ، أو ISAC. تم استخدام متوسطات الفئات هذه لحساب نموذج ثلاثي الأبعاد قابل للتكرار باستخدام RVIPER. يتفق هذا النموذج بشكل جيد مع التركيب البلوري الذي تم حله مسبقا ل TcdA1.
أدىالتحسين ثلاثي الأبعاد التلقائي لهذا النموذج باستخدام MERIDIEN إلى إنشاء تحليل map. 3D التباين شبه الذري إلى المرونة الموضعية للمنطقة الطرفية N التي تحمل علامة الهيستيدين ، ومجالات ربط المستقبلات ، ومجال ربط TcB. تم إجراء حسابات الدقة المحلية.
تمت تصفية النموذج الحاد محليا وتم تطبيق مقياس ألوان يتوافق مع الدقة المحلية ، مما يدل على الاتفاق الطوبولوجي بين المناطق ذات التباين العالي والمناطق ذات الدقة المنخفضة. أظهر الهيكل النهائي للتبريد الكهرومغناطيسي بدقة 3.5 أنغستروم ل TcdA1 كثافات واضحة لمعظم السلاسل الجانبية. يمكن استخدام خريطة الكثافة بهذا المستوى من التفاصيل لبناء النموذج الذري من جديد.
باستخدام هذا النهج ، يمكن الحصول على هيكل دقة شبه ذري في غضون ساعات أو بضعة أيام ، دون معلومات هيكلية مسبقة. أثناء محاولة هذا الإجراء، استخدم فقط بيانات عالية الجودة وتحقق من النتائج الوسيطة. قد يكون عدم التجانس التركيبي والهيكلي لعينة cryo-EM عاملا مقيدا للوصول إلى دقة شبه ذرية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك الآن فهم جيد لكيفية استخدام SPHIRE للتحديد الهيكلي للتبريد. كما رأيت ، فإن إجراءات التجميع المضمنة في SPHIRE ستسمح لك ليس فقط بحل بنية البروتين محل الاهتمام ، ولكن أيضا لدراسة الديناميكيات التوافقية وتوفير نظرة ميكانيكية حاسمة للآليات الجزيئية المعقدة.
نظرة عامة
تقدم هذه الورقة بروتوكول لمعالجة صور المجهر الإلكتروني الجليدي باستخدام مجموعة برمجيات SPHIRE. تنطبق هذه الطريقة على مشاريع الجسيمات المفردة لتصوير الإلكترون تستهدف دقة قريبة من الذرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء البنيوي
- المجهر الإلكتروني الجليدي
- معالجة الصور
الخلفية
- التصوير الإلكتروني الجليدي للجسيمات المفردة هو تقنية أساسية لدراسة الهياكل الجزيئية الكبيرة.
- يوفر SPHIRE نهجًا شبه آلي لمعالجة بيانات التصوير الإلكتروني الجليدي.
- يشدد البروتوكول على أهمية جودة العينة للحصول على نتائج عالية الدقة.
- يشتمل SPHIRE على آلية تحقق تلقائية لتكرار النتائج.
هدف الدراسة
- لتوفير بروتوكول مفصل لمعالجة صور التصوير الإلكتروني الجليدي.
- لتيسيير تحديد هياكل المعقدات الجزيئية الكبيرة.
- لتعزيز إمكانية الوصول إلى تقنيات التصوير الإلكتروني الجليدي للباحثين.
الطرق المستخدمة
- استخدام برمجيات SPHIRE لمعالجة الصور.
- اختيار الجسيمات يدويًا وآليًا من صور التصوير الإلكتروني الجليدي.
- التصنيف ثنائي الأبعاد وإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد.
- التحسين ثلاثي الأبعاد وتقدير التباين لدقة محسنة.
النتائج الرئيسية
- الإنشاء الناجح لنماذج ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للبروتينات.
- تحقق من متوسطات الفئات واتجاهات الجسيمات.
- تأسيس بروتوكول قابل للتكرار لمعالجة بيانات التصوير الإلكتروني الجليدي.
- تحديد هياكل ذات دقة ظاهرية عالية.
الاستنتاجات
- يعمل بروتوكول SPHIRE على تبسيط معالجة صور التصوير الإلكتروني الجليدي بشكل كبير.
- تعتبر بيانات الإدخال عالية الجودة ضرورية لتحقيق نتائج موثوقة.
- تعزز هذه الطريقة فهم هياكل المعقدات الجزيئية الكبيرة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Cryo-EM enables near-atomic resolution structural determination of macromolecular complexes, providing critical insights for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. SPHIRE streamlines this process through semi-automated workflows and objective validation, reducing barriers for novice users and enhancing reproducibility across teams. This supports predictive confidence in structural biology inputs for lead identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving macromolecular structures at near-atomic resolution.
- Operational Value: Provides reproducible 3D models from as few as 9,500 particles, supporting rapid target validation cycles.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by visualizing side-chain densities and conformational dynamics in toxin complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, noise-free atomic models suitable for structure-based assay design.
- Operational Value: Standardizes particle picking and classification through GUI-controlled, semi-automated pipelines.
- Reproducibility: Automatic validation ensures objective results across users and sites, enabling assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical by delivering high-resolution models for docking and mutagenesis studies.
- Mechanistic Insight: Reveals localized flexibility in domains such as receptor-binding regions, informing functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of structural heterogeneity that may impact developability.
Pipeline & Workflow Integration
SPHIRE integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural data that informs compound design and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via 3D variability analysis and local resolution mapping to assess conformational states.
- Screening: Delivers standardized, dose-weighted micrographs and class averages for reliable particle preparation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resolution estimates, angular distribution, and variability maps for data-driven decisions.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by producing sharpened, locally filtered 3D models suitable for atomic model building.
- Enterprise Reuse: GUI-driven workflow allows reuse across projects with minimal retraining, promoting platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Near-atomic resolution models reduce mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Semi-automated processing minimizes user intervention and increases throughput.
- Strategic Value: Objective validation improves go/no-go decisions by reducing structural uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets with validated structural models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology and cryo-EM sample preparation.
- Depends on GPU-accelerated workstations for 3D refinement and variability analysis.
- Necessitates standardized data collection parameters (voltage, exposure, defocus) across teams.
- Performance limited by sample heterogeneity and preferential orientation.
- Relies on external tools like Chimera for visualization and validation.
