التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تنظيف قلب الفأر كيميائيا ، مع عدم انتظام ضربات القلب المستحث لتصور عضو كامل لتسلل القلب الكريات البيض عن طريق الفحص المجهري للورقة الضوئية الفلورية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث الأعضاء بأكملها حول الأطراف الاصطناعية والهياكل على مستوى الدقة الخلوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحديد الالتهاب وتوطينه في الأعضاء بأكملها.

إعطاء دواخل مفصلة في الأطراف الاصطناعية العصبية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا في حاجة ماسة إلى أداة تصور لتحديد التفسيرات الخلوية لعدم انتظام ضربات القلب في وحدة النضوب. بعد عرض القلب من فأر عمره ثمانية إلى 10 أسابيع ، استخدم قسطرة قياس 21 واخترق البطين الأيمن.

قم بشق الشريان الأورطي للسماح بتصريف الدم ثم قم بتقطيعه بخمسة ملليلتر من PBS بالإضافة إلى EDTA ، بضغط ثابت بطيء. اتبع PBS EDTA بخمسة ملليلتر من 4٪ بارافورمالدهايد. في نهاية التروية ، استخدم ملقطا مسننا لإمساك القلب الثابت برفق ، واسحب العضو قليلا لأعلى لقطع جميع وصلات الأنسجة.

بما في ذلك الشرايين والأوردة الواردة والصادرة. بعد ذلك ، قم بتخزين القلب لمدة أربع ساعات في 4٪ PFA طازج لمزيد من التثبيت. لتجفيف الأنسجة ، احتضان القلب في سلسلة من الإيثانول الصاعد ، في أنابيب تفاعل البولي بروبيلين السوداء سعة خمسة ملليلتر في الظلام ، مع دوران بطيء مستمر على دوار الأنبوب ، لمنع تكوين فقاعة الهواء.

بعد ذلك ، قم بتنظيف الأنسجة بحضانة 98٪ ثنائي بنزيل الأثير مع دوران مستمر بين عشية وضحاها. لإجراء الفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة ، ضع أولا كتل الاغاروز المجففة في حامل العينة القياسي ، لتثبيت العينة في مكانها. ثم انقل العينة إلى حامل العينة.

بعد ذلك ، انقل حامل العينة إلى كوفيت مملوء بثنائي بنزيل إيثر بحجم مناسب. استخدم إعدادات مرشح الإثارة والانبعاث المناسبة ، للكشف عن إشارات التألق ذات الأهمية. لذا فإن تحديد موضع العينة وتثبيتها بشكل صحيح أمر أساسي لتقليل تأثيرات التظليل أثناء التصوير.

علاوة على ذلك ، يمكن أن تتسبب العينة السائبة في حدوث قطع أثرية متحركة ، يصعب إضاءةها أثناء المعالجة اللاحقة. بعد طلب جميع الصور ، افتح برنامج تحليل معالجة الصور ثلاثي الأبعاد و 4D المناسب ، وحدد تجاوز. اختر ملف وافتح، وحدد المجلد الذي يحتوي على البيانات من القناة الأولى المكتسبة لفتح مكدسات الصور.

حدد تحرير وإضافة القنوات، لإضافة بيانات قناة الفلورسنت المكتسبة المناسبة. بعد ذلك ، انقر فوق تحرير وتحديد خصائص الصورة ، لتصحيح أبعاد x و y و z voxel. ضبط المعلمات في النافذة المفتوحة حديثا.

لضبط إشارات الفلورسنت ، افتح أولا قائمة التحرير وحدد إظهار ضبط العرض. نافذة جديدة تعرض جميع القنوات المفتوحة. لتغيير قناة التألق الذاتي إلى تدرج الرمادي ، حدد قناة التألق الذاتي ، واختر نمط العرض الأبيض وانقر فوق موافق.

ثم اضبط العرض عن طريق إزالة الشبكة. ثم قم بالتكبير وإلغاء تحديد قناة واحدة. بعد ذلك ، اضبط قيمة المستوى الأسود لاستبعاد أي إشارات خلفية غير مرغوب فيها لا تمثل هياكل العينة وشدة الإشارة والتباين.

اضبط القناة الدائمة للجسم المضاد فيما يتعلق بإشارة قناة التألق الذاتي المنقحة. ضبط وضع القناة ، أطلق النار لضبط تصور إشارة الجسم المضاد على جدول بحث ألوان خريطة الحرارة. ثم حدد وضع المزج لتصور هياكل الأنسجة بالتفصيل.

لقطع العضو فعليا، قبل تصدير المشهد ثلاثي الأبعاد، حدد أيقونة مستوى القطع في قائمة الكائنات. سيظهر إطار أصفر ومناور عمود دوران أبيض في عرض الصورة. استخدم الماوس لتدوير عمود الدوران في الطرف الرقيق، لتغيير اتجاه مستوى القطع، وحرك الجزء الأوسط السميك من عمود الدوران لتحديد العمق المطلوب للقطع.

بعد ذلك ، قم بإلغاء تحديد خانات الاختيار المعنية لإخفاء الإطار والمناور وإنشاء اللقطات المطلوبة. يؤدي الحصول على مجموعة صور كاملة ، تتكون من إشارتين لقناة الفلورسنت ، إلى عرض ثلاثي الأبعاد اصطناعي ، حيث يتم عرض توزيع الكريات البيض في عرض خريطة حرارية. يمكن إدراك المناطق الملتهبة بشدة من القلوب من معالج بسموم الخناق من خلال مظهرها المحمر الأبيض.

خاصة في مناطق نظام التوصيل القلبي ، مثل حزمة البطين الأذيني وألياف بركنجي. في المقابل ، فإن قلوب المعالجة بنظام تلفزيوني الخاضعة للرقابة لا تظهر هذا النمط من الالتهاب. بمجرد إتقانها ، تسمح هذه التقنية بالتحليل الرقمي الجاهز للعضو المستهدف ، من حصاده إلى التسليم بمساعدة الكمبيوتر في غضون أربعة إلى خمسة أيام.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الإيمان ، لاستكشاف أنماط التوزيع الخلوي في أعضاء الفئران الكاملة. قد يتقدم هذا في العمر في تحليل وعلاج مجموعة متنوعة من الأطراف الاصطناعية للأمراض الفيزيولوجية المرضية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد أعضاء الفأر بالكامل للفحص المجهري لورقة ضوء التألق وكيفية إنشاء ومعالجة مكدسات البيانات ثلاثية الأبعاد.