وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged المتفطرة السلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد هياكل مجمعة من البلاعم المصابة بالمتفطرة السلية بشكل متكرر في شكل 96 لوحة بئر لاختبار الحساسية للأدوية باستخدام صبغة قابلة للحياة. يمكن لهذه الطريقة تحسين عملية تطوير الأدوية المبكرة للمركبات المضادة للسل ، والتي تعيقها الترجمة غير المنتجة للمركبات المرشحة إلى البيئة السريرية. الميزة الرئيسية لهذا النموذج البسيط وغير المكلف والمتوافق مع BSL في أنه يلخص حواجز الاختراق الخلوي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ، والتي تذكرنا بالورم الحبيبي لمرض السل.

ينتج عن هذا نتائج حساسية للأدوية أكثر تنبؤية بفعالية في الجسم الحي. ابدأ هذا الإجراء بتحضير بروتين فلورسنت أخضر يعبر عن M.tuberculosis MC squared 6206 ، المشار إليه فيما يلي باسم MTBGFP ، للعدوى. ضع في اعتبارك أن هذه سلالة شديدة الحساسية ، لذلك يمكن تنفيذ جميع الأعمال في البروتوكول الموضح هنا في منشأة السلامة البيولوجية من المستوى الثاني.

لكل 96 لوحة بئر ليتم إعدادها ، يتم إعداد جهاز طرد مركزي عند 2.8 مرات 10 إلى MTBGFP الثامن عند 3 ، 200 مرة G لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي متأرجح دلو. بعد الدوران ، استنشق المادة الطافية وأضف خمسة ملليلتر من RPMIC لغسل البكتيريا. الماصة لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلية.

ثم جهاز الطرد المركزي مرة أخرى. بعد الدوران الثاني ، اسكب المادة الطافية الخلايا البكتيرية في سبعة ملليلتر من RPMIC ، ثم الدوامة لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، لكل لوحة 96 بئر يتم إعدادها ، جهاز الطرد المركزي سبع مرات 10 إلى الخلايا البشرية الوحيدة THP1 السادسة عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق.

بعد الطرد المركزي ، اسكب المادة الطافية وأعد تعليق خلايا THP1 في سبعة ملليلتر من RPMIC. بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة 96 بئر للعدوى عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من الماء المعقم إلى الآبار في الصفوف A و H والعمودين الأول و 12. ستمنع حافة الماء هذه تبخر وسط الاستزراع.

أضف 200 ميكرولتر من RPMIC إلى العمود الثاني ، B اثنين إلى G اثنين ، للتحكم في الخلفية أو فارغة. لإصابة الخلية الأحادية THP1 ، استخدم ماصة لنقل المعلق البكتيري MTBGFP المحضر بالكامل إلى تعليق خلية THP1 وخلط الإرادة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. كثافة خلايا THP1 النهائية هي خمسة أضعاف 10 إلى الخامس لكل مليلتر وازدواجية العدوى المقابلة هي 40.

بعد ذلك ، اسكب تعليق THP1 MTBGFP في خزان سعة 25 مليلتر ، ثم باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 200 ميكرولتر من تعليق THP1 MTBGFP لجميع الآبار ال 96 المتبقية ، من E ثلاثة إلى G 11. احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ CO2 لمدة سبعة إلى 10 أيام. كل يومين طوال فترة الحضانة ، استخدم ماصة متعددة القنوات لتغيير الوسط عن طريق إزالة 100 ميكرولتر من الوسط المستهلك ببطء من أعلى كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من RPMIC الدافئ مسبقا برفق.

عند تغيير الوسط ، من المهم الحرص على عدم إزعاج مجاميع البلاعم MTB في قاع الآبار. كل يوم فحص الآبار بصريا باستخدام مجهر مضان ، مجهز بمجال ساطع ومجموعات مرشحات GFP بهدف من أربعة إلى 10 X. لاحظ حجم مجمعات البلاعم MTB والتقط الصور إذا رغبت في ذلك.

بحلول اليوم من سبعة إلى 10 مليون مكعب يجب أن تكون مجاميع البلاعم كبيرة بما يكفي للمضي قدما في اختبار فعالية الدواء ، كما هو موضح لاحقا في الفيديو. لاختبار المخدرات ، قم بإعداد دواءين مضادين للسل في ثلاث نسخ على صفيحة جديدة 96 بئر على النحو التالي. أولا ، أضف 125 ميكرولترا من 7H9C المتوسطة إلى الآبار B اثنين إلى G 10.

بعد ذلك ، قم بإعداد الدواءين بضعف أعلى تركيز نهائي مطلوب في مليلتر واحد من 7H9C. باستخدام ماصة ، أضف 250 ميكرولترا من كل دواء إلى الآبار B و C و D 11 ثم E و F و G 11 على التوالي للعلاجات الثلاثية. بعد ذلك ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، قم بتخفيف أدوية الاختبار بشكل متسلسل مرتين عن طريق نقل 125 ميكرولتر من B 11 إلى G 11 إلى B 10 إلى G 10.

امزج عن طريق سحب العينة خمس مرات في كل خطوة. استمر في تحريك 125 ميكرولتر من عمود إلى آخر من اليمين إلى اليسار عبر اللوحة ، وتوقف بعد العمود الرابع. بعد خلط العمود الرابع ، تخلص من 125 ميكرولتر في حاوية نفايات.

يجب ألا يحتوي العمودان الثاني والثالث على أي أدوية. سيسمح ذلك باستخدامها كخلفية ولضوابط النمو الإيجابية. بعد ذلك ، استرجع لوحة البئر 96 التي تحتوي على البلاعم المصابة MTB من الحاضنة.

بدون إمالة اللوحة، استخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة 150 ميكرولتر من الوسط من الآبار من B اثنين إلى G 11. ثم قم بإمالة اللوحة كما هو موضح هنا ، وأدخل أطراف الماصة في الحافة السفلية للآبار وقم بإزالة الوسط المتبقي ، حوالي 50 ميكرولترا. نظرا لأن مجاميع البلاعم MTB تلتصق بقاع البئر ، فلا ينبغي فقد أي مواد.

ومع ذلك ، يجب أن تكون إزالة الوسيط لطيفة قدر الإمكان ويجب توخي الحذر لتجنب إعادة التعليق أثناء هذه العملية. أضف برفق 100 ميكرولتر من وسط 7H9C إلى الآبار B اثنين إلى G 11 من اللوحة ، والتي تحتوي على مجاميع البلاعم MTB. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، انقل 100 ميكرولتر من الدواء الذي يحتوي على 96 صفيحة بئر إلى الآبار المقابلة للوحة العدوى.

ثم ضع الطبق في كيس محكم الغلق واحتضنه لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية. يعتمد اختبار ريزازورين على الأنواع المؤكسدة التي تنتجها MTB النشطة الأيضية لتحويل الريزازورين الأزرق إلى ريسوروفين وردي فلوري. يمكن استخدام التغيير في اللون والفلورة كعلامة بديلة لتحديد كمية نمو البكتيريا.

تحضير محلول مخزون من الريزازورين بتركيز نهائي قدره 8 ملليغرام لكل مليلتر في الماء. قم بالتصفية من خلال غشاء PVDF بحجم المسام 22 ميكرومتر للتعقيم. قم بإعداد محلول عملي في الريزازورين عن طريق خلط محلول المخزون والماء و Tween-80 بنسبة اثنين إلى واحد إلى واحد.

التركيزات النهائية هي 4 ملليغرام لكل مليلتر ريزازورين ، و 5٪ توين -80. باستخدام قارئ الألواح ، قم بإعداد برنامج لقراءة التألق عند إثارة 530 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر لمدة 24 ساعة كل 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 20 ميكرولترا من محلول عمل الريزازورين إلى الآبار B من اثنين إلى G 11 من الصفيحة المعالجة بالدواء. ضع اللوحة على القارئ وابدأ البرنامج. للتأكد من متانة تكييف نموذج العدوى هذا مع تنسيق 96 لوحة بئر ، تم تقييم قابلية MTB rifampicin RIF في موكسي فلوكساسين موكسي كما هو موضح في هذا الفيديو.

كما هو موضح هنا ، تم إنشاء هياكل مجمعة البلاعم MTB بنجاح في شكل لوحة 96 بئر وبالتالي تمكين من خلال التوافق مع الوضع. لقياس تحويل الريزازورين كميا كمؤشر لنمو البكتيريا ، تمت مراقبة مضان الآبار الفردية حركيا لمدة 24 ساعة. يتم تحديد وجود خلايا MTB قابلة للحياة من خلال تحويل صبغة الريزازورين الزرقاء إلى شكلها الوردي المخفض ، والذي ينعكس كميا من خلال شبكات z المضان النسبية في النقطة الزمنية للتشبع.

توضح هذه الرسوم البيانية المصغرة التمثيلية وحدات التألق الناتجة الموضحة على المحور Y مقابل الوقت الموضح على المحور X. لتوليد منحنيات قتل الحساسية للأدوية ، تم تطبيع الآبار المعالجة بالريفامبيسين والموكسيفلوكساسين إلى الحد الأقصى لنمو MTB بدون مراقبة المخدرات على أنه 100٪ للبقاء على قيد الحياة. تم طرح الإشارات الفارغة للتحكم في الخلفية من كل عينة بئر.

تم رسم النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة لكل تركيز فردي من العلاج بالعقاقير لتوليد منحنى القتل. تظهر هذه البيانات أن الحد الأدنى من التركيز المثبط يحدد أدنى تركيز للمضاد الحيوي حيث لوحظ تثبيط النمو بنسبة 90٪ أكبر من ميكروغرامين لكل مليلتر ، لكل من ريفامبيسين وموكسيفلوكساسين ضد MTB المشتق من نموذج العدوى الخاص بنا. على هذا النحو ، فإن الحد الأدنى من التركيز المثبط لهذين الدواءين ضد MTB باستخدام نموذج العدوى والمقايسة الخاص بنا هو أكثر انعكاسا لنشاط هذه الأدوية في الجسم الحي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء هياكل مجمعة من البلاعم المصابة ب MTB بشكل موثوق ومتكرر لاختبار الحساسية للأدوية باستخدام مقايسة ريزازورين. باتباع هذا الإجراء ، يتم إجراء تعديل قالب الدواء من عقارين كما هو موضح في لوحة مكتبة الأدوية 58 بسهولة لتمكين فحص المخدرات من خلال وضع.