تقييم Cardiomyocyte الأنواع الفرعية بعد إعادة برمجة بوساطة عامل النسخ من الفأر الجنينية الخلايا الليفية

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في توليد وقياس مجموعة متنوعة من الأنواع الفرعية للخلايا العضلية القلبية المستحثة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية وأساسية تتعلق بتحول السلالة الخاص بالنوع الفرعي أثناء إعادة برمجة القلب، مثل الإشارات الضرورية التي تنظم تجميع القسيمات العضلية وتحديد النوع الفرعي. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها توفر وسيلة لقياس التأثيرات الكمية على تحديد النوع الفرعي القلبي، وهو أمر ضروري لإجراء دراسات الآليات.

للبدء، قم بعزل الخلايا الليفية الجنينية للفأر من أجنة في المرحلة E 12.5. قم بتخزينها في النيتروجين السائل كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد ذلك، قم بحصاد خلايا plat-E وازرعها بمعدل مليون خلية لكل بئر في طبق مكون من ستة آبار، بحيث تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 80% خلال 24 ساعة.

قم بتغطية الخلايا بوسط التعداء (transfaction media) وحضنها في ظروف الزرع القياسية. وفي اليوم الذي يسبق يوم التجربة، أحضر أنبوب بولي ستيرين مخروطي سعة 15 milliliter واخلط 60 microliters من الوسط منخفض المصل مع ستة microliters من كاشف التعداء لكل تفاعل. حضن الخليط لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بما أن استخدام كاشف التعداء (transfection reagent) يتطلب ذلك، قم بإضافة الكاشف مباشرة إلى الوسط الغذائي منخفض المصل لتجنب أي انخفاض في كفاءة التعداء. بعد ذلك، أضف إجمالي ميكروغرامين من مزيج GHMT لكل تفاعل، ثم انقر على الأنبوب برفق للمزج. قم بحضن التفاعل لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم أضف المزيج إلى خلايا plat-E على شكل قطرات.

سجّل تاريخ ووقت عملية عفن الخلايا (transfection). قم بحضن خلايا plat-E التي خضعت للعفن طوال الليل. قبل ساعة من زراعة الخلايا الليفية الجنينية للفأر، جهّز طبقاً يحتوي على 24 بئراً للفحص الكيميائي النسيجي المناعي عن طريق إضافة شرائح تغطية بقطر 12 millimeter مغلفة بالفبرونيكتين إلى كل بئر.

بعد ذلك، أضف 300 µL من محلول كولاجين البقر إلى كل بئر واترك الطبق في الحضانة لمدة ساعة واحدة. وقبل نهاية فترة التحضين، قم بإذابة أنبوبة مجمدة من خلايا HCN4GFP mouse embryonic fibroblast. قم بإذابة الخلايا بسرعة، واغسلها مرة واحدة باستخدام وسط زراعة الخلايا الليفية (fiberblast media) المُدفأ مسبقاً، ثم قم بحساب تركيز الخلايا الحية.

بعد ذلك، قم بشفط محلول الطلاء من الطبق ذي الـ 24 بئراً، وقم فوراً بنثر 30,000 خلية لكل بئر فوق شرائح التغطية المطلية بالكولاجين والفيبرونيكتين. بعد 24 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection)، قم بترشيح وسط الفيروسات القهقرية عبر مرشح من أسيتات السليلوز الخالي من المواد الخافضة للتوتر السطحي بمسام حجمها 0.45 micron، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. بعد ذلك، أضف مادة polybrene للوصول إلى تركيز نهائي قدره 8 µg/mL.

قم بتجديد وسط زراعة خلايا plat-E بعناية بإضافة 2 mL من وسط عفن ناقل (transfection medium) طازج. قد يؤدي تغيير الأوساط بسرعة كبيرة إلى انفصال الخلايا. تنتج خلايا plat-E التي تتم صيانتها بشكل صحيح متوسط عشرة ملايين وحدة عدوى لكل 1 mL.

يرتبط التعبير العالي لبروتين GFP وكثافته في أكثر من 95% من الخلايا عادةً بالنجاح في توليد خلايا تشبه الخلايا العضلية القلبية المستحثة بوساطة GHNT. بعد ذلك، قم بسحب الوسط من الأرومات الليفية الجنينية المستنبتة وأضف وسط الفيروسات الارتجاعية الذي تم جمعه حديثاً. ثم أعد الطبق إلى الحاضنة واتركه للتحضين طوال الليل.

في اليوم التالي، قم بنقل الوسط من خلايا plat-E إلى الأرومات الليفية الجنينية مرة أخرى. تخلص من خلايا plat-E بعد عملية جمع الفيروس الثانية. بعد 48 ساعة من التحفيز، قم بسحب الوسط المحيط بالخلايا واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

ثم أضف 500 µL من الوسط المخصص لتحفيز الخلايا الشبيهة بالخلايا العضلية القلبية المسخن مسبقاً لكل بئر من أطباق الزرع ذات الـ 24 بئراً. استبدل الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام على مدار الـ 12 يوماً التالية. وبعد 14 يوماً من التحفيز، اشفط الوسط بعناية واغسل كل بئر باستخدام 300 µL من محلول PBS المبرد بالثلج.

بعد ذلك، قم بإزالة PBS وأضف 250 microliters من محلول paraformaldehyde بتركيز 4% لكل بئر، ثم حضن الخلايا لمدة 15 minutes في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بنفاذية الخلايا عن طريق غسل الآبار ثلاث مرات لمدة five minutes باستخدام 300 microliters من tritonex 100 بتركيز 0.1% و PBS. اسحب محلول النفاذية الزائد بعد الغسلة الأخيرة، ثم أضف محلول حجب عام (universal blocking buffer) بحجم 300 microliters لكل بئر.

يُترك للمنع (Block) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تُصبغ مجموعة واحدة من الشرائح طوال الليل باستخدام أجسام مضادة من الفأر ضد alpha actenin، ومن الدجاج ضد GFP، ومن الأرنب ضد NPPA لتحديد الخلايا العضلية القلبية الشبيهة بناظم الخطى والمستحثة ضمن الخلايا العضلية الشبيهة بالأذين والمستحثة. وفي اليوم التالي، تُغسل الآبار ويُضاف الجسم المضاد الثانوي المناسب كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق.

بعد إجراء عمليات غسيل إضافية، أضف 2.4 microliters من وسط التثبيت (mounting media) إلى شريحة مجهرية زجاجية. خذ غطاء الشريحة من طبق الـ 24 well plate وأزل المحلول الزائد. ثم انقله إلى الشريحة الزجاجية التي تحتوي على وسط التثبيت.

لكل شريحة، ابدأ من أحد الحواف وابدأ بالمسح صعوداً وهبوطاً في قناة الفلورة الحمراء لتحديد الخلايا الموجبة لبروتين alpha-actinin والموجبة للقسيمات العضلية (sarcomere). يسهل تحديد تخططات القسيمات العضلية عند الطول الموجي 555 nanometer. وبمجرد تحديدها، انتقل إلى القناة الخضراء وسجّل ما إذا كانت الخلايا موجبة.

ثم انتقل إلى جهاز الكمبيوتر لتقييم الطول الموجي للأشعة الحمراء البعيدة 647 nanometer للبحث عن صبغ NPPA أو MYL2. الخلايا التي تكون موجبة لـ alpha-actinin، وموجبة للساركومير، وسالبة لـ Hnc4-GFP، وموجبة لـ Nppa هي خلايا عضلية قلبية مستحثة شبيهة بالخلايا الأذينية. سيظهر صبغ Nppa بشكل نقطي ومحيط بالنواة.

أولاً، قم بعدّ الخلايا بعد 24 ساعة من الاستزراع كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. بعد ذلك، افحص كل خلية على شريحة غطاء بصرياً للتأكد من صبغ alpha-actinin والقسيم العضلي (sacromere) بشكل صحيح، وسجّل عدد الخلايا التي صُبغت إيجابياً لكلا العلامتين. ثم، اقسم هذا العدد على إجمالي عدد الخلايا الفعلية التي تم زرعها.

ستنتج تجربة إعادة البرمجة المتوسطة ما يقرب من 1% من الخلايا التي تكون موجبة لكل من alpha-actinin والقسيم العضلي (sarcomere). وبحلول اليوم 14، يمكن إيقاف التجربة وتقييم تنظيم القسيم العضلي. ويتم تحديد ذلك من خلال صبغة alpha-actinin الموجبة الموضحة هنا باللون الأحمر.

تعتبر الخلايا التي تظهر تنظيماً للقسيمات العضلية (sarcomere organization) هي الوحيدة القادرة على الخفقان التلقائي، لذا يعد هذا فحصاً أولياً جيداً. تظهر هنا خلايا عضلية قلبية محفزة تشبه خلايا منظم ضربات القلب من فئران مراسلة Hcn4-GFP. تظهر ثلاث خلايا في هذا العرض تنظيماً للقسيمات العضلية.

توجد ثلاث تجمعات خلوية إيجابية لـ Hcn4-GFP في مركز الصورة ويمكن تحديدها على أنها نوع من الخلايا الناظمة لضربات القلب. ويمكن ملاحظة خلية واحدة في أسفل اليسار مع صبغ alpha-actinin ولكن دون تنظيم للساركومير أو وجود علامة مميزة للنوع الفرعي. وفي هذه المجموعة من الخلايا العضلية القلبية المستحثة الشبيهة بالبطينية، تظهر الخلية المركزية تنظيماً للساركومير، كما تعطي هذه الخلية صبغاً إيجابياً لعلامة سلسلة الميوسين الخفيفة MYL-2 والتي تعد علامة للخلايا العضلية القلبية البطينية.

بمجرد إتقان العملية، يمكن إجراء عملية زرع ونقل الجينات لخلايا plat-E في غضون ساعة واحدة. ويستغرق تحفيز الخلايا الليفية الجنينية للفئران من ساعة إلى ساعتين، بينما يستغرق التحديد الكمي للميوتو لصفيحة كاملة مكونة من 24 بئرًا حوالي ثماني ساعات. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الخلايا الليفية الجنينية السليمة للفئران والفيروسات ذات العيار العالي هي عوامل أساسية لنجاح تجربة إعادة البرمجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد وقياس الأنواع الفرعية الفردية للخلايا القلبية المستحثة.