تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية
أبريل 15, 2017
هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وصلاحيتها للفحص المخدرات القلب.
الهدف العام لهذه التقنية هو توليد أنسجة قلب هندسية ثلاثية الأبعاد يمكن استخدامها كمنصة لتحليل الانقباض في المختبر لفحص الأدوية ونمذجة الأمراض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال القلب حول نمذجة الأمراض ، وعلم الأدوية الآمن وتأثيرات المتغيرات الجينية ، أو الأدوية على قوة الانقباض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن قياس قوة الانقباض في أنسجة القلب المهندسة من أنواع مختلفة في ظل ظروف معقمة ، لفترات طويلة من الزمن.
يمكن أن يعاني العلماء الجدد على هذه الطريقة من نقص الجودة الخلوية. أو عدم وجود في الوسط. من المهم تحسين الإعداد الذاتي وتجنب دورات إثبات هذا الإجراء سيكون أنيكا بنزين وأمبر سليم.
قبل البدء في الإجراء ، أضف 1.6 مل من الاغاروز الدافئ بنسبة 2 في المائة في آبار الإسعافات الأولية للوحة 24 بئر. ووضع البولي تترافلورو إيثيلين على الفور في الفواصل في الاغاروز. بعد حوالي 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، سيصبح الاغاروز معتما ، مما يدل على تصلبه.
قم بإزالة الفواصل وضع رفوف PDMS في المسبوكات بحيث تصل أزواج أعمدة الرف إلى كل قالب agarose. عندما يتم وضع جميع الرفوف ، نقوم بتعليق خلايا عضلة القلب في وسط بتركيز لا يقل عن 1.5 مرة 10 إلى الخلايا السبع لكل مليلتر وتخلط إعادة التكوين المحضرة حديثا مع الفيبرينوجين من 10 إلى 15 مرة باستخدام الماصة المصلية حتى يتم إذابة جلطة الفيبرينوجين. تحقق من مزيج إعادة التكوين في الماصة للتأكد من التجانس.
ثم لكل نسيج قلب مصمم هندسيا ، أو EHT ، امزج 100 ميكرولتر من مزيج إعادة التكوين مع ثلاثة ميكرولتر من الثرومبين في أنبوب سعة 200 ميكرولتر. وعلى الفور ، قم بنقل 100 ميكرولتر من خليط الثرومبين EHT في فتحات الاغاروز. استخدم طرف مرشح جديد لكل EHT.
بمجرد ملء جميع الفتحات بمزيج إعادة التكوين ، أغلق غطاء طبق زراعة الخلايا واحتضن المستحضرات لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية وسبعة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. في نهاية الحضانة ، ضع اللوحة في غطاء معقم وقم بتغطية كل بئر ب 200 إلى 500 ميكرولتر من المتوسط. رج الطبق برفق وأعد EHT إلى الحاضنة.
بعد 10 دقائق ، انقل الرفوف بعناية إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 1.5 مل من وسط EHT لكل بئر وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا في ظل ظروف الثقافة المناسبة. إطعام EHT كل يوم اثنين وأربعاء وجمعة ، عن طريق نقل رفوف PDMS إلى طبق ثان بوسط جديد. بعد سبعة إلى 10 أيام من الصب ، يجب أن تظهر EHT تقلصات تلقائية تحرف أعمدة رفوف PDMS.
لتحليل تقلصات EHT ، في يوم التجربة ، قم بتشغيل جهاز التسخين في أداة تحليل EHT قبل ساعتين من القياس. قبل التحليل مباشرة ، قم بتشغيل إمدادات الغاز والإلكترونية لنظام المحور. للحصول على تسجيل أساسي ، ضع لوحة EHT في أداة تحليل EHT وابدأ برنامج تحليل الانكماش وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
باستخدام إرشادات دليل البرنامج لبدء تشغيل جديد، انقر فوق علامة التبويب البروتوكول لإدخال معلومات الدراسة ذات الصلة. افتح علامة تبويب الإعداد واختر الآبار للتحليل. نظرا لضيق الوقت ، يتم توضيح ذلك فقط لاثنين من EHT في هذا الفيديو.
ثم انقر فوق علامة التبويب عرض الكاميرا وابدأ الوضع المباشر للكاميرا باستخدام وضع الكشف التلقائي عن الشكل. اضبط موضع الكاميرا بإحداثيات xyz لكل بئر محدد في طبق 24 جيدا ، مع الحرص على أن يكون كل EHT في وسط النافذة وفي التركيز. تأكد من أن الصلبان الزرقاء موجودة في الأطراف العلوية والسفلية من EHT وتتحرك لتتناسب مع تقلصات EHT.
واضغط على الزر "الموضع بخير" لحفظ مواضع الإعداد لكل بئر. انقر الآن فوق علامة التبويب المعلمات لتحديد المعايير التي يحدد البرنامج من خلالها ذروة الانكماش ، مع تمييز القمم بالمربعات الخضراء. احفظ جميع الإعدادات التي تم إدخالها عن طريق الضغط على زر استخدام المعلمات في جميع الآبار.
ثم انقر فوق علامة التبويب التلقائية وزر البدء لتسجيل انقباضات EHT الأساسية ولحساب انقباض خط الأساس التلقائي لكل EHT. سيتم عرض تحليل الانكماش المباشر في علامة التبويب في الوقت الفعلي. تأكد من أن الصلبان الزرقاء تتحرك عموديا فقط لتتناسب مع تقلصات EHT.
لتحليل تأثيرات دواء معين ذي أهمية على الانقباضات ، قم أولا بنقل صفيحة 24 بئر مملوءة بمحلول الغدة الدرقية الخالي من البروتين تحت غطاء معقم ووضع أقطاب الكربون في الآبار. انقل EHT في رفوف PDMS الخاصة بهم أعلى الأقطاب الكهربائية وأعد EHT إلى الحاضنة. بعد حوالي نصف ساعة ، ضع EHT في تشابك أداة تحليل EHT وسجل انقباض خط الأساس التلقائي لمدة 20 ثانية لكل EHT.
بعد ذلك ، قم بتوصيل أقطاب الكربون بكابل السرعة وابدأ في تحفيز EHT كهربائيا. سجل خط الأساس المنتظم لمدة 10 ثوان لكل EHT ، مع الحرص على أن يتم سير وتيرة جميع EHT بشكل صحيح. يتم الآن تمييز إشارة السرعة بخطوط عمودية زرقاء ، مدرجة في طعم الانكماش قبل كل ذروة.
بعد التسجيل الأساسي ، انقل الأقطاب الكهربائية ورفوف PDMS إلى لوحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على تركيز الدواء الأول وأعد EHT على الفور إلى تشابك أداة تحليل EHT لمدة 20 دقيقة. أعد توصيل كبلات السرعة واضبط التعرف على الشكل وسجل تقلصات EHT استجابة لتركيز الدواء الأول. بعد اختبار جميع تركيزات الدواء ، احفظ جميع تسجيلات PDF الناتجة وتحقق من كل تسجيل للتعرف على الشكل والوضع الصحيح لمربعات ذروة الانكماش والتحف.
للتحليل دون اتصال، انقر فوق تحديد تشغيل للتشغيل المعني من قاعدة بيانات عمليات التشغيل وفي علامة تبويب المعلمة، قم بتغيير المعلمة لتحليل الانكماش. ثم في علامة التبويب "غير متصل" ، اختر التحليل دون اتصال لإعادة تحليل مقاطع الفيديو. لضبط التعرف على الشكل وتسجيل ملف فيديو جديد.
اضبط التعرف على الشكل في علامة التبويب في الوقت الفعلي وحدد عينة المراجعة. سيتم الآن تحليل EHT وفقا للمواقع الجديدة. يعتمد تحليل كل EHT على التعرف على الشكل في الأطراف العلوية والسفلية للأنسجة.
ثم يتم تحليل تقلصات EHT المصورة تلقائيا بواسطة خوارزمية برنامج أداة تحليل EHT ويتم تحديد القمم وفقا للمعايير المحددة مسبقا ذات الصلة. يوضح القياس طويل المدى لتحليل انكماش EHT أنه لا توجد تغييرات واضحة تعتمد على الوقت في قوة الانكماش أو تردد الضرب أو انكماش T1 أو أوقات استرخاء T2 لمدة تصل إلى 20 ساعة. مما يشير إلى مستوى عال من الاستقرار للإنشاءات.
حقا, النتائج لكل إشارة [إهت] استنسخت مع تباين منخفضة. ومع ذلك ، يؤدي التعرض لمانع قناة hERG إلى إطالة وقت استرخاء T2 بشكل كبير ، بدءا من التركيز. ونمط ضرب غير منتظم بتركيزات أعلى.
بمجرد إتقانها ، يمكن إنشاء 24 EHT في غضون 30 دقيقة إذا تم إجراء التحضير بشكل صحيح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال نمذجة الأمراض لاستكشاف تأثير المتغيرات الجينية في المختبر. يسمح تعدد استخدامات هذا النموذج بدمجها مع الخلايا الجذعية المستحثة البشرية أو تقنية تحرير الجينوم.
باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام طرق إضافية مثل علم الأنسجة أو تحليل الحمض النووي الريبي والبروتين للإجابة على أسئلة إضافية حول نسخ الجينات والتعبير عنها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فكرة جيدة عن كيفية إرسال وتحليل EHT. إذا كان لديك أي أسئلة بخصوص هذا الإجراء ، فلا تتردد والاتصال بنا مباشرة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تظهر هذه الدراسة توليد نسيج قلبي مهندس ثلاثي الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) لتحليل الانقباض في المختبر. تتيح الطريقة تقييم قوة الانقباض وتأثير العوامل الدوائية، مثل مثبط قناة hERG E-4031، على أنماط الانقباض.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- هندسة الأنسجة القلبية
- الصيدلة
- بحوث الخلايا الجذعية
الخلفية
- يمكن للأنسجة القلبية الهندسية أن تحاكي الأمراض القلبية.
- تعد المنصات في المختبر أساسية لفحص الأدوية وعلم الصيدلة الآمن.
- فهم قوة الانقباض أمر بالغ الأهمية لتقييم الوظيفة القلبية.
- تشمل التحديات الحفاظ على جودة الخلايا وتحسين ظروف الثقافة.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة قوية لتوليد نسيج قلبي مهندس.
- تحليل تأثيرات الأدوية على انقباض القلب.
- توفير منصة لدراسة المتغيرات الجينية وتأثيرها على وظيفة القلب.
الطرق المستخدمة
- توليد نسيج قلبي مهندس من الخلايا العضلية القلبية المستمدة من hiPSC.
- قياس قوة الانقباض في ظروف معقمة.
- تقييم أنماط الانقباض استجابةً للعوامل الدوائية.
- تحسين ظروف الثقافة لجودة الخلايا.
النتائج الرئيسية
- نجاح توليد نسيج قلبي مهندس وظيفي.
- تبين تغيير أنماط الانقباض مع E-4031.
- تدعم قوة الطريقة استخدامها في فحص الأدوية.
- إمكانية الدراسات طويلة الأمد على الوظيفة القلبية.
الاستنتاجات
- توفر الطريقة أداة قيمة لأبحاث القلب.
- تمكن من دراسة تأثيرات الأدوية على نسيج القلب في المختبر.
- تشمل التطبيقات المستقبلية نمذجة الأمراض وعلم الصيدلة الآمن.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Automated contraction analysis of human engineered heart tissue provides a scalable, standardized platform for early cardiac drug safety screening, enabling quantitative assessment of contractile force and drug-induced arrhythmia risk. This approach supports mechanistic de-risking by replicating human cardiac responses to pharmacological agents like hERG inhibitors, improving target validation confidence. The method enhances predictive value in lead identification by bridging stem cell-derived models with functional readouts relevant to clinical safety outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through force-generating human heart tissue models that reflect disease-relevant contractile physiology.
- Operational Value: Supports biological de-risking by detecting drug effects on contraction kinetics and relaxation times in a human-derived system.
- Predictive Value: Generates quantitative data on T2 prolongation and beating irregularity to prioritize targets with improved cardiac safety profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, sterile 3D tissues in 24-well format compatible with automated imaging and contraction analysis workflows.
- Quantitative Output: Measures shortening-based force via PDMS post deflection, enabling dose-response assessment of compounds like E-4031.
- Scalability: Allows generation of several hundred engineered heart tissues per week, limited only by cardiomyocyte availability, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human cardiomyocytes to model contraction dynamics, improving translational alignment with human cardiac function.
- Mechanistic Continuity: Captures auxotonic contractions and relaxation parameters that reflect electromechanical coupling, supporting preclinical risk assessment.
- Decision Support: Enables replication of drug-induced contractile changes, informing go/no-go decisions in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, providing functional validation of molecular targets in a human tissue context.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on gene variants and drug effects by measuring real-time contractile force in engineered human heart tissue.
- Screening: Delivers reproducible, automated contraction readouts that support assay standardization and compound screening under controlled conditions.
- Analytics: Generates quantifiable parameters including contraction amplitude, beating frequency, and T2 relaxation time for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Uses human-derived tissues to bridge in vitro findings with clinical safety expectations, particularly for ion channel liabilities.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for cardiac safety screening that can be applied across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in cardiac drug response.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through automated figure recognition and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying cardiotoxic compounds early, reducing late-stage attrition risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative safety signals derived from human heart tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac tissue engineering, sterile cell culture, and cardiomyocyte handling.
- Depends on imaging hardware with XYZ axis control and automated figure recognition software for contraction detection.
- Necessitates cross-team standardization of tissue generation, drug exposure, and analysis protocols for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to different cell sources or genetic models while maintaining tissue integrity and function.
- Limited by cardiomyocyte availability and maturation state, which affects contractile performance and assay consistency.
