الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

الهدف العام من هذه الطريقة هو استخدام شرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) لتصور تموضع وحركة أنواع مختلفة من الخلايا المناعية في الرئة. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة، مثل أنماط تموضع وهجرة الخلايا المناعية في الرئة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تصور تفاعلات متعددة في الأنسجة الحية خارج الجسم (ex vivo) التي تحافظ على البنية ثلاثية الأبعاد للرئة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول تموضع وانتقال الخلايا المناعية أثناء الالتهاب، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لتصور انقباض أنسجة الممرات الهوائية والعضلات الملساء. ولحصد أنسجة الرئة، استخدم المقص أولاً لفتح الجلد والبريتون من منتصف البطن وصولاً إلى فك فأر يتراوح عمره بين 6 و12 أسبوعاً، وقم بإزاحة الأمعاء إلى جانب التجويف البطني. اقطع الوريد الأجوف السفلي لتصريف الدم بعيداً عن الرئتين، واستخدم الطرف المدبب للمقص لثقب الحجاب الحاجز للسماح بتمدد القفص الصدري.

بعد ذلك، استخدم الملقط لسحب الغدد اللعابية والأنسجة الأخرى يدوياً بعيداً عن الرغامي، واستخدم ملقطاً دقيقاً لإجراء شق في الرغامي على الجانب الأمامي لأسمك حزمة غضروفية، بحيث يكون الشق كبيراً بما يكفي للسماح بإدخال إبرة قياس 20 gauge. الآن، قم بتمرير إبرة قياس 20 gauge بطول 1.5 inch في قطعة من أنابيب البولي إيثيلين، واقطع الأنبوب بزاوية 45 درجة تقريباً. قم بتوصيل الإبرة بمحقنة سعة 1 milliliter، واسحب 0.8 milliliters من agarose منخفض نقطة الانصهار بتركيز 2% وبدرجة حرارة 40 درجة Celsius إلى داخل المحقنة.

عند الانتهاء من تحميل كل كمية الأغاروز، أدخل الطرف المائل للأنبوب في الشق، ثم احقن الأغاروز ببطء في الرئتين. وبدون تحريك الإبرة أو المحقنة، قم بتثبيت المحقنة إلى القاعدة البوليسترينية باستخدام شريط لاصق لتأمين الإبرة داخل القصبة الهوائية، وضع الحيوان في وحدة تخزين بدرجة حرارة 4 degrees Celsius لمدة 10 دقائق على الأقل. وبمجرد أن يتصلب الأغاروز، استخدم المقص لاستئصال الرئتين بعناية، وضعهما في طبق بقطر ثلاثة سنتيمتر يحتوي على PBS مبرد بالثلج.

بعد ذلك، قم بتدوير الفص المخصص لتقطيع الأنسجة بحيث يكون الجزء الداخلي من الرئة الذي يتصل بالرغامى مواجهًا للأسفل. لتقطيع أنسجة الرئة، ضع أولاً قطرة صغيرة من غراء All Purpose No Run gel superglue على مكبس حقنة معدني، مع توزيع الغراء بحركة دائرية. وعند الانتهاء من وضع الغراء، استخدم الملاقط للإمساك بالفص المستأصل فوراً وبلطف بحيث يكون جانب الرغامى للأسفل، ثم جفف الفص باستخدام منديل ورقي لإزالة السوائل الزائدة.

ضع الفص المجفف بعناية فوق المكبس، وقم بقص أي أنسجة زائدة تمتد خارج حافة المكبس. حرك المكبس لأسفل بحيث ترتفع جوانب المحقنة المعدنية وتتجاوز الأنسجة، مما يؤدي إلى تكوين تجويف تكون الرئة في قاعه داخل ساق المحقنة بعمق لا يتجاوز عدة سنتيمترات. ضع شريطاً لاصقاً حول قاعدة المحقنة لتثبيت المكبس في مكانه.

ثم اسكب بعناية Agarose منخفض الانصهار بتركيز 2% وبدرجة حرارة 40 degrees Celsius داخل المحقنة بحيث يغطي الجزء العلوي من الفص تماماً، وأحط المحقنة المعدنية بكتلة تبريد مثلجة. بعد مرور دقيقة إلى دقيقتين، ضع محقنة العينة في القاطعة الآلية، وقم بمحاذاة الشفرة الجديدة. بعد ذلك، املأ خزان المحلول المنظم بـ PBS مبرد بالثلج.

قم بمحاذاة مشغل المحرك الخطوي مع سرنجة العينة، ثم أزل الشريط اللاصق. أدر المفتاح إلى وضع التقديم السريع، حتى يلامس مشغل المحرك الخطوي الجزء الخلفي من المكبس. اضبط إعدادات سمك النسيج، والقطع الفردي المستمر، والتذبذب، والسرعة في جهاز التقطيع.

ثم اضغط على زر البدء واستخدم ملعقة مسطحة رفيعة لجمع كل شريحة من شرائح الرئة الكريستالية (PCLS) عند سقوطها في خزان المحلول المنظم، مع وضع الشرائح في آبار فردية من طبق يحتوي على 24 بئرًا ويحتوي على PBS بارد جدًا. ولتصوير PCLS الساكن، انقل عينات الرئة التي تحتوي على المنطقة التشريحية المستهدفة إلى أطباق فردية سعة ثلاثة سنتيمترات تحتوي على 1 mL من مزيج الأجسام المضادة المناسب والمستهدف. وبعد مرور 30 إلى 60 دقيقة على الثلج مع الرج والحماية من الضوء، اشطف الشرائح مرتين باستخدام 1 mL من PBS بارد جدًا.

بعد ذلك، أضف 50 µL من PBS في طبق زجاجي جديد ذو قاع مستدير بقطر 3 cm لكل عينة، وانقل الشرائح بسرعة إلى كل قطرة، مع تحريك قطع الأنسجة برفق بحيث تكون مفرودة بشكل مسطح. ثم اسحب PBS باستخدام ماصة، وضع قطرة من وسط التثبيت في درجة حرارة الغرفة على الشريحة، متبوعة بغطاء شريحة زجاجي. لتصوير النسيج، ضع الطبق على منصة مجهر بؤري (confocal microscope) تحت عدسة شيئية 20x، واستخدم أداة تقسيم الصورة (tile tool) لتحديد وعلامات حواف النسيج في إعداد الغلاف المحدب (convex hull) لتقليل وقت مسح المربعات.

ثم حدد نطاق مجموعة z-stack، مع التأكد من أن النطاقات المحددة مناسبة في مناطق متعددة من الشريحة، لا سيما على طول الحواف. وبالنسبة لتصوير الخلايا الحية، وبعد 30 دقيقة من الحضن في خليط الأجسام المضادة المطلوب، اشطف الشرائح مرتين باستخدام 1 mL من Leibovitz 10 البارد. بعد ذلك، أضف 50 µL من Leibovitz 10 الطازج في فتحة واحدة من غطاء زجاجي غرفة لكل عينة، متبوعاً بالنقل الفوري لكل PCLS إلى الوسط، مع تحريك الأنسجة بلطف حتى يتم بسطها بشكل مسطح.

ثم استخدم ماصة لسحب الوسط من كل حجرة وتثبيت كل شريحة من شرائح الرئة المقطوعة بالليزر (PCLS) باستخدام وزن بلاتيني. ضع بعناية بواسطة الماصة مصفوفة خارج خلوية مُعدة حديثاً ومبردة بالثلج فوق كل شريحة PCLS، مع التأكد من وضع الهلام فوق شرائح الرئة، وعدم طفو الشرائح فوق اله gelatin. بعد خمس دقائق عند 37 درجة مئوية، انقل الشريحة إلى حجرة مجهر بؤري مُدفأة مسبقاً ومضبوطة عند 37 درجة مئوية تحت عدسة شيئية بقوة 20x.

بعد ذلك، قم بضبط نطاقات مكدس z والتبليط (tile ranges) بناءً على الفاصل الزمني المطلوب بين الإطارات، وذلك باستخدام أداة التبليط لتحديد المنطقة ذات الأهمية في النسيج، وإعداد الشبكة المركزية لتوسيط العينة في مجال الرؤية. تتركز الخلايا التغصنية التقليدية ذات التعبير العالي عن CD11b في برنشيمة الرئة، بينما تستقر الخلايا التغصنية التقليدية الموجبة لـ CD103 بشكل أساسي حول الممرات الهوائية والمنطقة تحت الجنبية. ويسمح الصبغ المشترك لـ CD88 و CD172a بالتمييز بين البلاعم السنخية السالبة لـ CD172a والموجبة لـ CD88، وبين البلاعم الخلالية الموجبة لـ CD172a والموجبة لـ CD88، والتي تقع الأخيرة بشكل تفضيلي في البرنشيمة، وليس في المنطقة تحت الظهارية.

يسهل التصنيف المشترك لـ CD90.2، وهو علامة معروفة للخلايا التائية، وبروتين الفلوريسنت TdTomato، وهو جين منتقل تحت التحكم النسخي لعامل نسخ رئيسي ضروري لتكوين الأوعية اللمفاوية، عملية تحديد البنى اللمفاوية في الرئة. توجد الخلايا الشجيرية التقليدية الموجبة لـ CD103 في عدة مناطق تشريحية، بما في ذلك ظهارة الممرات الهوائية التي تعبر عن CD324، والأوعية اللمفاوية، والمنطقة تحت الجنب. ويمكن تسجيل حركة الخلايا والتفاعلات بين الخلية والأخرى باستخدام التصوير الحي للخلايا كما تم توضيحه للتو.

على سبيل المثال، في التجربة النموذجية، يمكن ملاحظة الخلايا التغصنية الموجبة لـ CD103 بوضوح وهي تتفاعل مع الخلايا التائية النوعية لـ ova المنقولة تكيُّفيًا على مدار فترة زمنية تبلغ أربع ساعات، وذلك بعد مرور 16 ساعة على تثبيت ova-LPS عن طريق الفم. وبمجرد إتقانها، يمكن إتمام عمليات تحضير الأنسجة وتقنيات التقطيع في غضون ساعتين ونصف إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذا البروتوكول، من المهم تذكر تحقيق نفخ جيد للرئة باستخدام الأغاروز، والحفاظ لاحقًا على شرائح الرئة الرقيقة مسطحة قدر الإمكان من أجل التصوير.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل معالجة شرائح الرئة المقطوعة بدقة (PCLS) باستخدام الأسيتيل كولين أو الميتاكولين، للإجابة على أسئلة إضافية حول إشارات الكالسيوم وانقباض الممرات الهوائية في ظل ظروف مرضية مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج شرائح رئة مقطوعة بدقة لتصور تموضع الخلايا المناعية في الرئة وحركتها وتفاعلاتها.