باستخدام كامل-- جبل المناعية طريقة لدراسة التعصيب من القناة الصفراوية في سونكوس مورينوس
June 15th, 2017
نهج كامل المناعية جبل، لتصور التعبير البروتين العصبية في القناة الصفراوية خارج الكبد في سونكوس مورينوس. هنا. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتحليل التعصيب من جميع الأجهزة الحشوية في S. مورينوس أو الأنواع الأخرى.
الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام تلطيخ الكيمياء المناعية الكاملة لتصور توزيع الأعصاب داخل القناة الصفراوية ل Suncus murinus. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحليل التوزيع العصبي للأعضاء الحشوية للعديد من الأنواع ، وخاصة الأعضاء غير المنتظمة أو الصغيرة التي يصعب تقييمها بالطرق القياسية. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أن العملية بسيطة.
لا يتطلب إجراءات معقدة وله معدل نجاح مرتفع. سيعرض الإجراء معي Yidan Dai ، طالب دراسات عليا ، و Shuang-Qin Yi ، زميل باحث ، وكلاهما من مختبري. ابدأ بغسل باستخدام PBS الفردي و 4٪ من نضح بارافورمالدهايد في خزانة الدخان.
ثم حقن ملليلترين إلى ثلاثة ملليلترات من لاتكس النيوبرين الأبيض من خلال قسطرة التروية في الشريان الأورطي البطني لتسمية الأوعية الدموية. وعندما يتم وضع علامة على جميع الأنسجة ذات الأهمية ، استخرج أعضاء البطن والأعصاب والأوعية ذات الصلة. ثم قم بحقن ما يقرب من 0.1 مل من اللاتكس النيوبرين الأزرق في المرارة لتسمية الجهاز الصفراوي وإصلاح الأنسجة بعد ذلك في 4٪ بارافورمالدهايد بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية للتلوين المناعي بالكامل.
في صباح اليوم التالي ، انقل العينة إلى قارورة زجاجية لمدة أربع مرات غسل بدرجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الماء المقطر على مغذية. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الأنسجة في حمض تقويم العظام الطازج 1٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع أي تفاعلات جوهرية للبيروكسيداز. بعد ذلك ، اغسل العينة بالماء المقطر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، متبوعا بحضانة في بابيلون طازج 0.004٪ لمدة ساعتين في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف.
في نهاية الحضانة ، اغسل العينة بالماء المقطر لمدة 50 إلى 60 دقيقة. ثم قم بتخزين الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، اغسل العينة بالماء المقطر كما هو موضح للتو متبوعا بحضانة أخرى لمدة ساعتين في بابيلون طازج.
اغسل العينة لمدة 50 إلى 60 دقيقة أخرى في ماء مقطر ، متبوعا بالتثبيت طوال الليل في 4٪ بارافورمالدهايد. في صباح اليوم الثالث ، اغسل المناديل أربع مرات في الماء المقطر ، متبوعا بالغمر في ثلاث حضانات سكروز تصاعدية متتالية لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتجميد العينة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، متبوعا بالذوبان الكامل في درجة حرارة الغرفة.
بعد دورة التجميد والذوبان الثالثة ، انقل العينة إلى 2٪ Triton X-100 لمدة أربع درجات مئوية لحضانة بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، انقل العينة إلى وعاء من الجسم المضاد الأساسي محل الاهتمام للهزاز اللطيف على المغذي عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاثة إلى ستة أيام وفقا لحجم العينة. بعد فترة وضع العلامات المناسبة ، قم بإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط بأربع غسلات لمدة ساعة واحدة في PBS في درجة حرارة الغرفة وقم بتسمية العينة بالجسم المضاد الثانوي المناسب لمدة ثلاثة أيام مع هزاز لطيف عند أربع درجات مئوية.
في نهاية فترة وضع العلامات على الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل العينة أربع مرات في PBS. ثم احتضان الأنسجة في 10 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد الهيدروجين في 100 مل من محلول التلوين الطازج 0.002٪ DAB عند أربع درجات مئوية لمدة 16 إلى 72 ساعة مع هزاز لطيف. عند الوصول إلى شدة التلوين المثلى ، انقل العينة إلى 0.04٪ أزيد الصوديوم في PBS لإيقاف تفاعل التلوين.
ثم اغمر العينة بعناية في طبق بتري بطول 10 سم يحتوي على PBS طازج والتقط صورا كاملة للأنسجة باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر استريو. بالإضافة إلى تصور تعصيب القناة الصفراوية خارج الكبد ، فإن وضع العلامات بالجسم المضاد ضد الألياف العصبية الإيجابية للخيوط العصبية يسمح أيضا بتحديد لا لبس فيه لكثافة تشغيل وتوزيع العصب المبهم على طول المريء وفي المعدة. يكشف تسمية الأوعية الدموية للمرارة بلاتكس النيوبرين الأبيض عن التليف العصبي الرقيق في تناقض كبير مع الأنسجة المحيطة مع كثافة أعلى من التعصيب التي لوحظت في عنق المرارة مقارنة بقاع القاع.
في القناة الصفراوية العلوية ، يتم تصنيف نوعين من الحزم العصبية ، الحزم العصبية الدقيقة التي تشكل شبكة غير منتظمة وكثيفة من الأعصاب وتعمل بشكل لاصق على القناة الصفراوية وفي القناة الصفراوية والحزم العصبية السميكة التي يتم توزيعها بالتوازي مع سطح القناة الصفراوية. يسمح وضع العلامات على القناة الصفراوية المشتركة بلاتكس النيوبرين الأزرق والأوعية التي تحتوي على لاتكس النيوبرين الأبيض بتصور الألياف العصبية الرقيقة في نهاية القناة الصفراوية المشتركة ومنطقة الحليمة الاثني عشر. قبل محاولة هذا الإجراء ، احرص على تشغيل الجدول الزمني لكل تجربة لأن العملية برمتها تتطلب أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع حتى تكتمل.
لتجنب إتلاف العينة عند تغيير المحاليل ، اسكب المحاليل دائما بدلا من إزالة العينة بالملقط. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على تطبيق هذه التقنية على وضع العلامات على مجموعة من الأعصاب داخل الأعضاء الحشوية المختلفة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة نهجًا مناعيًا نسيجيًا كاملًا لتصوير تعبير بروتين الخيوط العصبية في القناة الصفراوية خارج الكبد في Suncus murinus. تتيح هذه الطريقة تحليل توزيع الأعصاب في الأعضاء الحشوية، خاصةً تلك الصغيرة أو غير المنتظمة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء المناعية النسيجية
- تحليل الأعضاء الحشوية
الخلفية
- الكيمياء المناعية النسيجية الكاملة هي تقنية تُستخدم لتصوير توزيع الأعصاب.
- يُعتبر Suncus murinus كائنًا نموذجيًا لدراسة تعصيب الأعضاء الحشوية.
- تعد هذه الطريقة مفيدة للأعضاء الصغيرة أو غير المنتظمة التي يصعب تقييمها باستخدام التقنيات القياسية.
- البروتوكول بسيط ويتمتع بمعدل نجاح مرتفع.
غرض الدراسة
- لتصوير توزيع الأعصاب داخل القناة الصفراوية في Suncus murinus.
- لتوفير طريقة موثوقة لتحليل التعصيب في مختلف الأعضاء الحشوية.
- لتوضيح الإجراء لأغراض تعليمية.
الطرق المستخدمة
- تفريغ الحيوان باستخدام PBS و4% من عمليات رش البرافورمالديهايد.
- الصبغ المناعي النسيجي الكامل.
- تصوير تعبير بروتين الخيوط العصبية.
- العرض من قبل طلاب الدراسات العليا وزملاء البحث.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لتوزيع الأعصاب في القناة الصفراوية.
- تقرير فعالية الطريقة للأعضاء الصغيرة وغير المنتظمة.
- معدل نجاح مرتفع للتقنية المناعية النسيجية الكاملة.
الاستنتاجات
- تعد طريقة الكيمياء المناعية النسيجية الكاملة فعالة لتحليل توزيع الأعصاب.
- يمكن تطبيق هذه التقنية على أنواع مختلفة من الحيوانات بخلاف Suncus murinus.
- البروتوكول بسيط ويمكن الوصول إليه للباحثين.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This whole-mount immunohistochemical method enables visualization of nerve distribution in visceral organs, supporting target validation in neurogastroenterology and autonomic nervous system research. By providing high-resolution mapping of innervation patterns in small or irregular organs, it aids mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in biliary tract function. The approach offers predictive confidence for early discovery programs focused on neural modulation of visceral organ physiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to vagal and visceral nerve function in biliary tract regulation.
- Operational Value: Provides a reliable method for functional target validation through direct visualization of neurofilament-positive nerve fiber distribution.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying neural pathway involvement in biliary tract homeostasis and disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline innervation maps in the biliary tract.
- Quantitative Output: Enables measurement of nerve fiber density and distribution patterns, supporting assay standardization and reproducibility.
- Platform Reuse: Adaptable to other neuronal antibodies, allowing scalable application across visceral organ systems after initial optimization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant system modeling by enabling consistent innervation analysis from discovery through preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by clarifying neural contributions to biliary tract function in preclinical models.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of structural innervation changes with functional readouts in translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly for neuro-modulatory approaches to biliary and visceral organ disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing nerve distribution in the biliary tract and associated organs like esophagus and stomach.
- Screening: Enhances assay readiness through standardized tissue preparation and high-success-rate immunostaining, enabling reliable compound effect evaluation on neural structures.
- Analytics: Generates quantitative neuroanatomical data on nerve bundle density and distribution, aiding comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling consistent innervation assessment across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable histology platform for visceral organ innervation studies, adaptable to multiple species and neuronal markers.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in neural control of visceral organs.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through a straightforward protocol with high success rate, minimizing technical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing clear neural anatomy data, reducing late-stage biological risk in neuro-visceral therapeutic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated innervation patterns in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry, tissue dissection, and confocal or stereo microscopy for whole-mount imaging.
- Dependent on access to primary and secondary antibodies, enzymatic inactivation reagents, and DAB substrate for colorimetric detection.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, permeabilization (e.g., Triton X-100), and antibody incubation conditions across laboratories.
- Involves adaptation considerations when applying to different visceral organs or species, particularly regarding antibody optimization and permeabilization times.
- Limited by the two- to three-week timeline per experiment, requiring planning for longitudinal studies.
![الجامعة-جبل [كنفوكل] الفحص المجهري للجلد الإذن الكبار: نظام نموذجي لدراسة Morphogenesis المتفرعة العصبية والأوعية الدموية وتوزيع الخلايا المناعية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F57406.jpg%3Fv%3D2026-07-04T03%253A41%253A42.000Z&w=384&q=75)
