تطبيق مشفرة وراثيا نيون اكسيد النيتريك (NO •) تحقيقات، وgeNOps، التصوير في الوقت الحقيقي من NO • إشارات في زنازين انفرادية

الهدف العام من نهج التصوير هذا هو مراقبة إشارات أكسيد النيتريك في الوقت الفعلي على مستوى الخلايا الفردية باستخدام فئة جديدة من مجسات أكسيد النيتريك الفلوري المشفرة وراثيا ، geNOps. بالنظر إلى أهمية أكسيد النيتريك في علم الأحياء وعلم وظائف الأعضاء ، فقد كان من المرغوب فيه تصور هذا الجزيء على المستوى الخلوي أو حتى تحت الخلوي منذ اكتشافه. نتخيل إشارات أكسيد النيتريك باستخدام مجسات جديدة ، بسيطة إلى حد ما ، قائمة على البروتين الفلوري ، geNOps.

تستجيب أكسيدات الأكسيد النهرية بشكل مباشر وفوري لأكسيد النيتريك عن طريق إخماد التألق. هذا يعني أنه يمكنك مراقبة حركية الوقت الفعلي لتوليد أكسيد النيتريك وانتشاره وتدهوره في الخلايا المفردة. الميزة الرئيسية ل geNOps هي أنه يمكنك في الواقع النظر إلى إشارات أكسيد النيتريك بدقة مكانية وزمانية عالية باستخدام مجهر مضان تقليدي.

ابدأ هذا الإجراء عن طريق استبدال المخزن المؤقت لخط الخلايا البطانية أو خلايا HEK293 بمليلتر واحد لكل بئر من محلول معزز الحديد (II) في درجة حرارة الغرفة. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة بالضبط في الظلام. يعد إجراء تحميل الحديد ضروريا للحصول على استجابة كاملة للمجسات ويمكن تكييفه مع أنواع الخلايا والتطبيقات المختلفة.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام مخزن التخزين المؤقت ، واحتضن كل بئر بملليلترين من مخزن التخزين المؤقت لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا بالتوازن. بعد ذلك ، استبدل المخزن المؤقت للتخزين ب 3.3 ميكرومولار Fura-2AM في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للتخزين. حماية الخلايا من الضوء ، واحتضانها لمدة 45 دقيقة.

بعد 45 دقيقة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن التخزين المؤقت ، واحتضنها مرة أخرى لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا بالتوازن. لبدء الإجراء ، قم أولا بإصلاح غطاء 30 ملم مغطى بخط الخلية البطانية أو خلايا HEK293 في غرفة التروية المعدنية. قم بتشغيل نظام التصوير ، ثم ضع حجرة التروية المعدنية على المجهر.

قم بتوصيل أنبوب التدفق بالخزانات العازلة ، ثم قم بتشغيل نظام التروية. الآن قم بتوصيل التدفق بمضخة تفريغ ، مما يضمن تدفقا ثابتا وتجنب تصريف الغطاء. ابدأ التروية التي تحركها الجاذبية باستخدام عازلة الكالسيوم الفسيولوجية باستخدام نظام التروية شبه الأوتوماتيكي.

بعد ذلك ، حدد إعدادات التصوير باستخدام البرنامج المعني. حدد الأطوال الموجية للإثارة 340 نانومتر و 380 نانومتر لتصوير Fura-2 و 480 نانومتر ل G-geNOp المثير. بعد ذلك ، حدد منطقة التصوير عن طريق تحريك جدول xyz للمجهر حتى يتم التركيز على العديد من الخلايا الفلورية.

ثم حدد مناطق الاهتمام. ارسم المناطق التي تغطي عدة خلايا فلورية مفردة كاملة لكل حقل تصوير. بعد ذلك ، حدد منطقة خلفية ذات حجم مماثل.

ابدأ في جمع البيانات على مجهر فلوري مقلوب ومتقدم مع مرحلة عينة آلية ومصدر ضوء أحادي اللون. بدلا من ذلك ، قم بإثارة الخلايا عند 340 نانومتر و 380 نانومتر ل Fura-2AM و 480 نانومتر ل G-geNOp ، على التوالي. قم بتعيين أوقات التعريض الضوئي الخاصة بها بحيث يمكن اكتشاف إشارة مضان واضحة بمرور الوقت لجميع القنوات.

اجمع الضوء المنبعث عند 510 نانومتر ل Fura-2AM و 520 نانومتر ل G-geNOp باستخدام كاميرا CCD مع مجموعة مرشحات مناسبة تتكون من المثير 500 نانومتر ، وثنائي اللون 495 نانومتر ، وباعث 510-520 نانومتر. ثم سجل إطارا إجماليا واحدا كل ثلاث ثوان. سجل الدقائق الثلاث الأولى في مخزن الكالسيوم الفسيولوجي للحصول على خط الأساس لإشارات التألق المعنية.

بمجرد ملاحظة تألق خط الأساس المستقر ، قم بالتبديل إلى الهيستامين 100 ميكرومولار أو ATP الذي يحتوي على عازلة الكالسيوم الفسيولوجية لتحفيز الخلايا لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك ، عد إلى عازلة الكالسيوم الفسيولوجية بدون الهيستامين أو ATP و L-NNA لمدة خمس دقائق لإزالة المركبات من الخلايا. بعد ذلك ، قم بإعطاء 10 ميكرومولار NOC-7 في مخزن الكالسيوم الفسيولوجي لمدة دقيقتين باستخدام نظام التروية.

يؤثر المتبرع بأكسيد النيتريك بشدة على مضان G-geNOp ، وعادة ما يقلل من الخلايا بأكثر من 20٪ استجابة ل 10 ميكرومولار NOC-7. في خلايا EA.hy926 ، يكون تأثير NOC-7 أقوى مقارنة بإخماد مضان G-geNOp الناجم عن ناهض. بعد ذلك ، اغسل المركب الذي يطلق أكسيد النيتريك لمدة 10 دقائق تقريبا باستخدام عازلة الكالسيوم الفسيولوجية ، وتوقف عن التسجيل بمجرد استعادة التألق القاعدي.

تظهر هنا ، هي صور التألق التمثيلية واسعة المجال لخلايا EA.hy926 التي تعبر عن G-geNOp المحملة ب Fura-2AM. وهنا ، هو المسار الزمني التمثيلي للتسجيلات المتزامنة لإشارات Fura-2 و G-geNOp استجابة للهيستامين 100 ميكرومولار. كما هو موضح ، تمت إزالة الهيستامين بعد ثلاث دقائق باستخدام نظام التروية.

تمثل هذه المنحنيات التسجيلات المتزامنة للكالسيوم العصاري الخلوي وإشارات أكسيد النيتريك لخلية بطانية محملة ب Fura-2AM تعبر بشكل عابر عن G-geNOp. تم تحفيز الخلايا بالهيستامين 100 ميكرومولار لمدة ثلاث دقائق في مخزن مؤقت يحتوي على الكالسيوم. والموضحة هنا ، هي إشارات الكالسيوم وأكسيد النيتريك المسجلة في وقت واحد بمرور الوقت لخلية EA.hy926 التي تمت معالجتها مسبقا باستخدام 500 ميكرومولار L-NNA قبل القياس.

عولجت الخلايا بالهيستامين 100 ميكرومولار في وجود مللي مولار من الكالسيوم. توضح هذه الأشكال متوسط المنحنيات التي تمثل إشارات أكسيد النيتريك العصاري الخلوي استجابة ل ATP واحد ميكرومولار متبوعا بتحفيز خلية ثان مع ATP 100 ميكرومولار. بمجرد إتقانها ، تتيح لك هذه التقنية تصور إشارات أكسيد النيتريك في الوقت الفعلي بأقل جهد.

أعتقد أن هذه التقنية ستمهد الطريق للباحثين لاستكشاف إشارات أكسيد النيتريك وإعادة التحقيق فيها في نماذج الخلايا المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية geNOps للتصوير في الوقت الفعلي لأكسيد النيتريك في نظام النموذج الخاص بك.