صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير الدورة الدموية لخلايا الدم في شبكية العين لدى الفئران باستخدام منظار العين الليزري الماسح. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول أمراض الشبكية، مثلما هي ديناميكيات أرضية الشبكية لخلايا WBCs وRBCs، وكيف يمكن لديناميكيات تدفقها أن تساهم في إمراضية المرض. تكمن المزايا الرئيسية لهذه التقنية في قدرتها على عكس الأنماط الظاهرية المختلفة للأمراض، بالإضافة إلى سهولة تنفيذها.

سيقوم أعضاء فريقنا، Praveen و Bo Bo و Neha، بشرح هذا الإجراء. لعزل طبقة خلايا الدم الماوس، ضع دمًا كاملاً تم جمعه حديثًا فوق محلول من polysucrose و sodium diatrizoate بنسبة 1:1 في أنبوب سعة 2 مل. ثم قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنبوب لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، قم بشفط وطرد السائل الطافي من البلازما. ثم اجمع بعناية طبقة الغشاء الكريمي (buffy coat) المكونة من الكريات البيضاء وطبقة الكريات الحمراء الموجودة أسفلها في أنابيب منفصلة. بعد ذلك، اغسل الكريات الحمراء باستخدام 1XPBS لإزالة أي ملوثات، ثم أعد تعليقها في حجم واحد من PBS.

بعد ذلك، انقُل حصصاً بمقدار نصف ملليلتر من المعلق إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. قم بطرد الحصص مركزياً، وتخلص من الراشح ثم أضف حوالي 200 microliters من 40%1XPBS إلى كريات الدم الحمراء المترسبة. اخلطها جيداً.

ثم تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، أضف 100 µL من ICG إلى كل معلق. اخلط الأنابيب عن طريق القلب، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

أضف بعد ذلك 300 µL من 1XPBS واحضن المزيج لمدة ساعة مع الرج الخفيف عند 37 °C. ثم قم بإجراء عملية طرد مركزي للمعلقات، واحتفظ بالخلايا المترسبة وأعد تعليقها في 1 mL من 1XPBS. استمر في غسل الخلايا باستخدام 1XPBS حتى يصبح الطافي رائقاً.

بعد سكب السائل الطافي، أضف حجماً واحداً من 1%BSA وPBS للوصول إلى 50% من الهيماتوكريت لكرات الدم الحمراء المسمى بـ ICG. بعد ذلك، قم بمعالجة تجميع الطبقة البيضاء. أولاً، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من 1XPBS لإزالة أي ملوثات.

قم بطرد العينات مركزياً مرة أخرى، ثم أعد تعليق الراسب في 900 µL من 1XPBS. بعد ذلك، أضف 100 µL من sodium fluorescein بتركيز 10%، واحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. وأخيراً، اغسل الخلايا اللمفاوية الموصومة ثلاث مرات باستخدام 10 mL من 1XPBS.

قم بالطرد المركزي ثم أعد تعليقهم في 100 µL من 1XPBS. ولتحضير كريات الدم الحمراء الموصومة بـ ICG للحقن، قم أولاً بتخفيف جزء من العينة المخصصة للحقن لتصل نسبة الهيماتوكريت إلى 5% أو 1%. قم بتخدير الفأر وتوسيع حدقتيه.

بعد ذلك، ضع مرهم العين في كلتا العينين. ثم ضع عدسة لاصقة فوق إحدى العينين. والآن، قم بتصوير الفأر باستخدام كاميرا SLO بؤرية مع عدسة ذات قوة +25 ديوبتر لتعويض انكسار العين.

قم بتوجيه القرنية بدقة نحو الرأس البصري لجهاز SLO. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة التصوير وتحريكها حتى يصبح العصب البصري في مركز شاشة التصوير. ثم التقط صور قاع العين بالأشعة تحت الحمراء بزاوية 30 درجة.

بعد ذلك، قم بتصوير فيديو لقاع العين بالأشعة تحت الحمراء. قم بتفعيل مرشح ICG بطول موجي 790 نانومتر، واضبط وضع الكاميرا على السرعة العالية، مع الحفاظ على زاوية الرؤية بين 15 إلى 30 درجة. ثم اضبط شدة ICG على 85 لجميع القراءات.

في لوحة التحكم، انقر على زر الاستحواذ (acquire) لتصوير فيديو مرجعي بمعدل 8.8 إلى 15 إطاراً في الثانية لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك، قم بتحميل 100 µL من كريات الدم الحمراء الموصومة بـ ICG في حقنة أنسولين ذات إبرة قياس 30، ثم احقن الخلايا في وريد الذيل أو عن طريق الحقن خلف الحجاج. فور الانتهاء من الحقن، التقط صورة جديدة لقاع العين بالأشعة تحت الحمراء وفيديو جديد باستخدام مرشح ICG.

بعد الحصول على مقاطع الفيديو، قم بتصديرها بتنسيق TIFF لتحليل الصور. قم بمعالجة الصور باستخدام حزمة برامج التصوير المتاحة مجانًا، MHJ. بعد فتح الملف، قم بضبط الفاصل الزمني للإطارات في فيديو الصور لقياسات السرعة.

افتح بعد ذلك إضافة MtrackJ. من القائمة، اختر التتبع (tracking) وقم بتفعيل خيار الانتقال إلى فهرس الإطار الزمني التالي بعد إضافة نقطة. حدد الآن خلية ذات أهمية وقم بتتبعها عبر كل إطار.

من القائمة، انقر فوق "إضافة" لإضافة مسار جديد، ثم انقر فوق الخلية المختارة. بعد ذلك، استمر في النقر على الموضع الحالي للخلية مع تقدم الصور من إطار إلى آخر. وبمجرد تتبعها، قم بتغيير خيار عرض المسار من خيارات العرض المتاحة، واختر عرض نقاط التتبع فقط في الوقت الحالي.

استمر في النقر حتى يتم عرض مسار الخلية، ثم احفظ المسار. انتقل الآن إلى تتبع الخلية التالية بالبدء بأمر الإضافة (add) والمتابعة كما فعلت مع الخلية الأولى. بعد تتبع جميع الخلايا المستهدفة، افتح عرض جميع قياسات المسارات باستخدام خيار القياس (measure).

بعد ذلك، احفظ المخرجات لإجراء المزيد من التحليلات. تم تصوير كريات الدم الحمراء الموصومة بـ 1.5%ICG في الدورة الدموية للشبكية في فئران C57 black 6J باستخدام هيماتوكريت بنسبة 1% أو 5%؛ حيث كانت الخلايا مميزة، ولكن في حالة الهيماتوكريت بنسبة 1% كان من السهل رؤية الخلايا الموصومة بشكل أكبر. ومع أي من التركيزين المحقونين، لوحظ وجود بعض الركود الدموي في المنطقة المجاورة للحليمة البصرية، وكان ذلك أكثر وضوحاً مع الهيماتوكريت بنسبة 5%.

تم وسم الكريات البيضاء بـ 1% sodium fluorescein، وتم تصويرها كخلايا موسومة باللون الأخضر باستخدام المجهر الفلوري. وقد لوحظ وجود بعض التكتلات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ست ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توسيع حدقة العينين للحصول على صور ومقاطع فيديو عالية الجودة للشبكية.