نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

الهدف العام لهذه الطريقة هو عزل بروتين G-quadruplex helicase G4 Resolvase1 من نظام التعبير البكتيري باستخدام خطوة تنقية فريدة تعتمد على ATP لعزل إنزيم نقي تقريبا ونشط تحفيزيا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة الباحثين في الحصول على بروتين مؤتلف G4 Resolvase1 نقي تقريبا ونشط تحفيزيا لنا في مجموعة واسعة من المقايسات الكيميائية الحيوية في المختبر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستبعد الإنزيم غير المطوي أو غير النشط تحفيزيا من تحضير البروتين.

نشأت فكرة استخدام ATP لتصفية الهليكاز G-quadruplex بعد عدم قدرته على التخلص من الإنزيم النشط تحفيزيا من حبات G4 ، حتى عند تركيزات الملح العالية بشكل استثنائي. قم بإعداد وتنمية المزارع البكتيرية الكبيرة التي تعبر عن G-quadruplex Resolvase1 أو G4R1 كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بإذابة الحبيبات البكتيرية في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت TN في درجة حرارة الغرفة.

أمسك الزجاجات في متناول اليد وقم بتحريكها لإذابة وتعليق الحبيبات البكتيرية. بمجرد إذابته وتعليقه بشكل متساو نسبيا ، يصل الحجم إلى خمسة ملليلتر مع مخزن TN المؤقت. بعد ذلك ، قم بإذابة 20 ملليغرام من الليزوزيم في 250 ميكرولتر من الماء لكل ثقافة وأضفها إلى البكتيريا المعلقة.

اسمح لليزوزيم بهضم البكتيريا لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا أثناء تحريك الزجاجات في متناول اليد. سيبدأ لون التعليق في التفتيح قليلا مع استمرار عملية الهضم ، وسيكون التعليق غير لزج نسبيا. أضف 250 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني المختصر PIC.

ثم أضف 10 ميكرولتر من الليببتين واخلطها جيدا. ضع المعلق على الثلج وأضف 10 مل من المخزن المؤقت البارد TN و 22 ميكرولتر من بيتا ميركابتو إيثانول أو BME. انقل التعليق إلى أنبوب سعة 50 مل.

صوتنة البكتيريا على الجليد باستخدام صوتي رقمي مضبوطة على 30٪ السعة. نبض لمدة ثانيتين وثانيتين لمدة دقيقة واحدة. كرر الصوتنة ثلاث مرات ، مما يسمح للعينات بالتبريد على الجليد لمدة دقيقتين على الأقل بين خطوات الصوتنة.

بعد ذلك ، أضف حجما متساويا من سترات الصوديوم المالحة الباردة أو SSC بالإضافة إلى BME و PIC والليوبتين واخلط المعلق. في جهاز طرد مركزي منضدية مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية الطرد المركزي المحلل عند 2 ، 300 مرة G لمدة 20 دقيقة. ثم انقل المادة الطافية إلى أنابيب 50 ملليلتر طازجة مبردة مسبقا.

خذ ملليلترا واحدا من حبات الستربتافيدين المغناطيسية ، أو تعليق SPB لكل ثقافة ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. بيليه SPB بمغناطيس. ثم اغسل SPB مرتين باستخدام اثنين من X SSC بالإضافة إلى خمسة مللي مولار EDTA PH8.

بعد ذلك ، قم بتعليق SPB المغسول في 200 ميكرولتر من نفس المحلول. أضف حصة واحدة من ثلاثة OD من G4 DNA إلى تعليق SPB. امزج بسرعة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل عدة مرات.

ثم ضع الأنابيب على دوار وقم بتدويرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد هذه الفترة من الدوران ، قم بحظر SPB المرتبط ب G4 عن طريق إضافة مليلتر واحد من 0.4٪ لاكتالبومين ، واستمر في وضع الثلج لحين الحاجة. لربط الهيستيدين الموسومة G4R1 المؤتلف بخرز الكوبالت ، أضف ملليلترا واحدا من ملاط حبة الكوبالت إلى كل أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على المحلل البكتيري المبصف.

احتضن الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز دوار. بعد الحضانة ، قم بتدوير حبات الكوبالت عند 110 مرات G لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي منضدي أربع درجات مئوية. استنشق السائل بعناية ، واترك بضعة ملليلترات من السائل حتى لا تزعج حبات الكوبالت المحببة.

بعد ذلك ، اغسل الخرزات ب 10 إلى 15 مل من البارد أربعة X SSC plus BME ، وحبيبات الخرز كما كان من قبل. صب المحللة المصفاة التالية على حبات الكوبالت المحببة. احتضن لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة على الدوار ، واغسل الخرزات ب 10 إلى 15 مل من أربعة X SSC بالإضافة إلى BME.

ثم ، قم بتكسير الخرزات عند 100 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الغسيل الثاني ، استنشق السائل واترك حوالي ملليلترين من الخرز والسائل في قاع الأنبوب. انقل حبات الكوبالت المرتبطة بالبروتين إلى أنبوب مليلتر مبرد مسبقا باستخدام طرف ماصة بعرض مليلتر واحد.

بإيجاز ، قم بالطرد المركزي للحبات في أنبوب المليلتر بسرعة عالية في جهاز طرد مركزي دقيق عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها برفق عن طريق سحب العينة مع الحرص على عدم فقدان حبات الكوبالت المرتبطة بالبروتين. ماصة 0.5 مل من المخزن المؤقت لشطف الهيستيدين ، أو HEB على الخرزات وإعادة تعليقها عن طريق قلب الأنبوب.

ثم احتضان حبات الكوبالت في HEB على دوار لمدة خمس دقائق في غرفة باردة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 18 ، 000 مرة G في جهاز طرد مركزي دقيق أربع درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة البروتين الذي يحتوي على مادة طافية برفق عن طريق سحب العينة بعناية مع ترك كمية صغيرة من السائل فوق حبات الكوبالت.

انقل المادة الطافية إلى أنبوب 15 ملليلتر مبرد مسبقا. كرر هذه الخطوات ليصبح المجموع ثلاث مرات HEB. ثم قم بإزالته مرة واحدة باستخدام 0.2 مولار EDTA عند درجة الحموضة 6.0.

سيتغير لون حبات الكوبالت من اللون الوردي إلى الأبيض حيث يخلب EDTA الكوبالت. بعد نقل هذا الشطف الرابع والأخير إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا، قم بعمل ماصة المخزن المؤقت للشطف المتبقي من حبات الكوبالت باستخدام طرف تحميل هلام في نهاية طرف ماصة سعة مليلتر واحد. عن طريق غمر الطرف في الجزء السفلي من الأنبوب ، يمكن جمع البروتين المتبقي المحتوي على محلول الشطف.

قم بتوجيه G4 SPB المحضر إلى جانب الأنبوب بمغناطيس وتخلص من المادة الطافية. بعد ذلك، أضف ملليلترا واحدا من المخزن المؤقت بثلاثة X دقة إلى G4 SPB والماصة للخلط. ماصة G4 SPB معلقة في ثلاثة X دقة عازلة في أنبوب 15 مليلتر يحتوي على ما يقرب من ملليلترين من البروتين المحتوي على HEB EDTA.

احتضن لمدة 15 دقيقة في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع التحريك العرضي حتى لا تستقر الخرز. بعد غسل البروتين G4 SPB كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتحبيير G4 SPB بمغناطيس على الجليد وأعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف الدافئ مسبقا. انقل الخرزات على الفور إلى أنبوب PCR مسخن مسبقا واحتضانه لمدة 30 ثانية عند 37 درجة مئوية.

أضف على الفور 12 ميكرولترا من خمسة كلوريد صوديوم مولي وماصة لأعلى ولأسفل بقوة 20 إلى 30 مرة. يعمل الجمع بين الملح العالي و ATP الموجود في المخزن المؤقت للشطف على التخلص من G4R1 المؤتلف من حبات G4. قم على الفور بتكسير G4 SPB بمغناطيس ، وانقل البروتين المحتوي على الشطوب إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد على الجليد.

بعد تكرار الشطف والنقل ، يكون المنتج النهائي حوالي 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف الذي يحتوي على G4R1 المؤتلف المنقى. أخيرا ، قم بإجراء مقايسة النشاط الأنزيمي لمراقبة الجودة لاختبار ما إذا كان قد تم تنقية المؤتلف عالي النشاط G4R1 كما هو موضح في بروتوكول النص. يوفر اختبار G4 مقياسا للنشاط الأنزيمي المؤتلف G4R1.

ضمن نطاق 0.2 إلى 0.013 ميكرولتر في الإنزيم ، يلاحظ عادة أن 50٪ من 0.2 بيكومول من رباعي ميثيل رودامين المسمى رباعي الجزيئات G4 DNA يتم تحويله إلى مونومرات. يشير وضع Coomassie للمؤتلف المنقى G4R1 إلى نطاق واحد بحجم 120 كيلو دالتون المتوقع مع نطاق ملوث طفيف عند حوالي 75 كيلودالتون. قد يمثل هذا النطاق G4R1 المؤتلف المقطوع الذي حافظ على قدرته على ربط حبات الحمض النووي G4 في الخروج بطريقة تعتمد على ATP.

يتم قياس نطاق الاهتمام مقابل منحنى البروتين القياسي. يحصل هذا البروتوكول عادة على 200 ميكرولتر من 20 إلى 100 إنزيم منقى نانومولار لكل لتر واحد من زراعة البكتيريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية بروتين G4 Resolvase1 من نظام التعبير البكتيري باستخدام خطوة تنقية فريدة تعتمد على ATP لعزل إنزيم نقي تقريبا ونشط تحفيزيا.

بمجرد إتقانها, ومع التحضير المسبق لحبيبات البكتيريا المجمدة, يمكن إجراء تنقية المؤتلف G4R1 في غضون ست ساعات تقريبا. للحفاظ على النشاط التحفيزي الأمثل للإنزيم ، من المهم الحفاظ على المستحضر على الجليد ، ما لم يذكر خلاف ذلك. استخدم دائما مثبطات الإنزيم البروتيني.

تجنب تكوين الفقاعات في الأنابيب. قم بتجميد الإنزيم المنقى بسرعة ، وتجنب دورات الذوبان غير الضرورية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في هذا المجال لتحديد الصلات المرتبطة وأنشطة الهليكاز لهذا البروتين بدقة لمجموعة واسعة من ركائز الحمض النووي والحمض النووي الريبي.

يمكن أيضا تكييف هذه الطريقة لتنقية إنزيمات الحمض النووي الأخرى المعتمدة على ATP والتي لم يعد ناتج التفاعل الأنزيمي لها ركيزة ملزمة للإنزيم.