نهج G-quadruplex الحمض النووي تقارب لتنقية نشط إنزيمي G4 Resolvase1

الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل بروتين G4 Resolvase1، وهو هليكاز لـ G-quadruplex، من نظام تعبير بكتيري باستخدام خطوة تنقية فريدة تعتمد على ATP لعزل إنزيم نقي تقريباً ونشط تحفيزياً. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد الباحثين في الحصول على بروتين G4 Resolvase1 معاد التركيب، يكون نقياً تقريباً ونشطاً تحفيزياً، لاستخدامه في مجموعة واسعة من المقايسات الكيميائية الحيوية في المختبر. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستبعد الإنزيمات ذات الطي الخاطئ أو غير النشطة تحفيزياً من تحضير البروتين.

نشأت فكرة استخدام ATP لشطف هليكيز G-quadruplex بعد التعذر في شطف الإنزيم النشط تحفيزياً من حبيبات G4، حتى عند استخدام تركيزات ملحية عالية للغاية. قم بتحضير وتنمية مستنبتات بكتيرية كبيرة تعبر عن G-quadruplex Resolvase1 أو G4R1 كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بإذابة الراسب البكتيري في ثلاثة milliliters من منظم TN في درجة حرارة الغرفة.

أمسك الزجاجات باليد وقم بتدويرها لفك تجميد وإعادة تعليق الكتلة البكتيرية. وبمجرد ذوبان الثلج وتعليق العينة بشكل متجانس نسبياً، يتم إكمال الحجم إلى 5 mL باستخدام محلول TN المنظم. بعد ذلك، قم بإذابة 20 mg من الليزوزيم في 250 µL من الماء لكل مزرعة وأضفها إلى البكتيريا المعاد تعليقها.

اترك الليزوزيم ليهضم البكتيريا لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق تقريباً مع تحريك الزجاجات يدوياً بشكل دائري. سيبدأ لون المعلق في التفتح قليلاً مع تقدم عملية الهضم، وسيكون المعلق غير لزوج بشكل نسبي. أضف 250 µL من كوكتيل مثبط البروتياز المختصر بـ PIC.

بعد ذلك، أضف مقداراً واحداً قدره 10 µL من leupeptin وامزجه جيداً. ضع المعلق على الثلج وأضف 10 mL من محلول TN المنظم البارد و 22 µL من beta mercaptoethanol أو BME. انقل المعلق إلى أنبوب سعة 50 mL.

قم بإجراء عملية السونكة للبكتيريا على الثلج باستخدام جهاز سونكة رقمي مضبوط على سعة 30%. استخدم نبضات مدتها ثانيتان من التشغيل وثانيتان من التوقف لمدة دقيقة واحدة. كرر عملية السونكة ثلاث مرات، مع ترك العينات لتبرد على الثلج لمدة دقيقتين على الأقل بين خطوات السونكة.

بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من محلول سترات صوديوم ملحي بارد بتركيز 4X (SSC) مضافاً إليه BME وPIC وleupeptin، ثم اخلط المعلق. وباستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي مبرد مسبقاً إلى 4 °C، قم بطرد المحللات مركزياً عند 2,300 ×g لمدة 20 دقيقة. ثم انقل الطافي إلى أنابيب سعة 50 milliliter مبردة مسبقاً.

خذ ملليلتر واحد من معلق خرزات الستريبتفيدين البارامغناطيسية (SPB) لكل مزرعة، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. قم بترسيب الـ SPB باستخدام مغناطيس. بعد ذلك، اغسل الـ SPB مرتين باستخدام محلول 2X SSC مضافاً إليه 5 millimolar EDTA PH8.

بعد ذلك، أعد تعليق الـ SPB المغسول في 200 µL من المحلول نفسه. أضف مقداراً من DNA G4 بتركيز 3 OD إلى معلق الـ SPB. اخلط المزيج سريعاً عن طريق السحب والضخ بالماصة عدة مرات.

بعد ذلك، ضع الأنابيب على جهاز تدوير وقم بتدويرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل. وبعد انتهاء فترة التدوير هذه، قم بحجب SPB المرتبط بـ G4 عن طريق إضافة 1 mL من lactalbumin بتركيز 0.4%، واحفظها على الثلج حتى وقت الاستخدام. ولربط G4R1 المؤتلف والموسوم بالهستيدين بخرزات الكوبالت، أضف 1 mL من ملاط خرزات الكوبالت إلى كل أنبوب سعة 50 mL يحتوي على المحلل البكتيري المصفى.

يُحضن الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على جهاز تدوير (rotator). وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم تدوير حبيبات الكوبالت لترسيبها بسرعة 110 ×g لمدة خمس دقائق في جهاز طرد مركزي مكتبي عند درجة حرارة 4 °C. يُسحب السائل بعناية، مع ترك بضعة ميليلترات من السائل لتجنب تعكير حبيبات الكوبالت المترسبة.

بعد ذلك، اغسل الخرز باستخدام 10 إلى 15 milliliters من محلول four X SSC بالإضافة إلى BME البارد، ثم قم بترسيب الخرز كما سبق. صبّ lysat المصفى التالي فوق خرز الكوبالت المترسب. قم بالتحضين لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة على جهاز الدوران (rotator)، ثم اغسل الخرز باستخدام 10 إلى 15 milliliters من محلول four X SSC بالإضافة إلى BME.

بعد ذلك، يتم ترسيب الحبيبات عند 100 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. وبعد غسلة ثانية، يتم سحب السائل مع ترك حوالي 2 mL من الحبيبات والسائل في قاع الأنبوب. ثم تُنقل حبيبات الكوبالت المرتبطة بالبروتين إلى أنبوب سعة 2 mL مبرد مسبقاً باستخدام طرف ماصة واسع الفوهة سعة 1 mL.

قم بطرد حبيبات الخرز في أنبوب السعة 2 مل طردًا مركزيًا قصيرًا وبسرعة عالية في جهاز طرد مركزي دقيق عند درجة حرارة 4 °C. قم بإزالة السائل الطافي والتخلص منه برفق باستخدام الماصة، مع توخي الحذر لعدم فقدان حبيبات الكوبالت المرتبطة بالبروتين. أضف 0.5 milliliters من محلول شطف الهيستيدين، أو HEB، فوق الحبيبات وأعد تعليقها عن طريق قلب الأنبوب.

بعد ذلك، يتم تحضين حبيبات الكوبالت في محلول HEB على جهاز تدوير لمدة خمس دقائق في غرفة باردة. ثم تُطرد المعلق مركزياً عند 18, 000 ×g في جهاز طرد مركزي دقيق عند درجة حرارة 4 °C لمدة دقيقة واحدة. تُزال الطبقة العليا التي تحتوي على البروتين بلطف عن طريق السحب الماهر بالمصّة، مع ترك كمية صغيرة من السائل فوق حبيبات الكوبالت.

انقل السائل الطافي إلى أنبوب سعة 15 milliliter مبرد مسبقاً. كرر هذه الخطوات لإجراء ثلاث عمليات شطف بـ HEB في المجمل. بعد ذلك، قم بعملية شطف واحدة باستخدام 0.2 molar EDTA عند pH 6.0.

سيتغير لون حبيبات الكوبالت من الوردي إلى الأبيض مع قيام EDTA بخلب الكوبالت. بعد نقل عملية الشطف الرابعة والأخيرة هذه إلى أنبوب سعة 15 milliliter، قم بسحب محلول الشطف المتبقي من حبيبات الكوبالت باستخدام طرف تحميل الجل مثبتًا على طرف ماصة سعة one milliliter. ومن خلال غمس الطرف إلى قاع الأنبوب، يمكن تجميع محلول الشطف المتبقي الذي يحتوي على البروتين.

استخدم مغناطيسًا لسحب حبيبات G4 SPB المُحضرة إلى جانب الأنبوب، ثم تخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، أضف 1 mL من محلول res buffer بتركيز 3X إلى حبيبات G4 SPB وقم بالخلط باستخدام الماصة. انقل حبيبات G4 SPB المعلقة في محلول res buffer بتركيز 3X بواسطة الماصة إلى أنبوب سعة 15 mL يحتوي على 2 mL تقريبًا من محلول HEB EDTA المحتوي على البروتين.

يُحضن الخليط لمدة 15 دقيقة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع الرج من حين لآخر لمنع ترسب الخرزات. وبعد غسل G4 SPB المرتبط بالبروتين كما هو موضح في البروتوكول النصي، يتم تجميع G4 SPB باستخدام مغناطيس على الثلج، ثم تُعاد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من محلول استخلاص مُدفأ مسبقاً. تُنقل الخرزات فوراً إلى أنبوب PCR مُدفأ مسبقاً وتُحضن لمدة 30 ثانية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

أضف على الفور 12 µL من كلوريد الصوديوم بتركيز 5 M وقم بالماصة صعوداً وهبوطاً بقوة من 20 إلى 30 مرة. يعمل المزيج من الملح عالي التركيز و ATP الموجود في محلول الاستخلاص على استخلاص G4R1 المؤتلف من حبيبات G4. قم بترسيب G4 SPB فوراً باستخدام مغناطيس، وانقل المستخلص الذي يحتوي على البروتين إلى أنبوب PCR جديد على الثلج.

بعد تكرار عمليتي الشطف والنقل، يكون المنتج النهائي عبارة عن 200 microliters تقريبًا من محلول الشطف الذي يحتوي على البروتين المأشوب G4R1 المنقى. وأخيرًا، يتم إجراء مقايسة النشاط الإنزيمي لمراقبة الجودة لاختبار ما إذا كان قد تم تنقية البروتين المأشوب G4R1 عالي النشاط كما هو موضح في البروتوكول النصي. وتوفر مقايسة G4 قياسًا للنشاط الإنزيمي للبروتين المأشوب G4R1.

في النطاق ما بين 0.2 إلى 0.013 microliter في الإنزيم، يُلاحظ عادةً أن 50% من 0.2 picomoles من G4 DNA رباعي الجزيئات والموسوم بـ tetramethylrhodamine يتم تحويله إلى مونومرات. ويشير صبغ Coomassie لبروتين G4R1 المؤتلف المنقى إلى وجود حزمة واحدة عند الحجم المتوقع البالغ 120 kilodalton مع وجود حزمة ملوثة ثانوية عند حوالي 75 kilodaltons. قد تمثل هذه الحزمة بروتين G4R1 مؤتلفاً مبتوراً حافظ على قدرته على الارتباط بخرز G4 DNA والتحرر منه بطريقة تعتمد على ATP.

يتم تقدير كمية الحزمة المستهدفة مقارنة بمنحنى قياسي للبروتين. يحصل هذا البروتوكول عادةً على 200 microliters من إنزيم منقى بتركيز يتراوح بين 20 إلى 100 nanomolar لكل لتر واحد من المزرعة البكتيرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية بروتين G4 Resolvase1 من نظام تعبير بكتيري باستخدام خطوة تنقية فريدة تعتمد على ATP لعزل إنزيم نقي تقريبًا ونشط تحفيزيًا.

بمجرد إتقان الطريقة، ومع التحضير المسبق لكريات البكتيريا المجمدة، يمكن إتمام عملية تنقية G4R1 المؤتلف في غضون ست ساعات تقريبًا. وللحفاظ على النشاط التحفيزي الأمثل للإنزيم، من المهم إبقاء التحضيرات على الثلج، ما لم يُذكر خلاف ذلك. يجب استخدام مثبطات البروتياز دائمًا.

تجنب تكون الفقاعات في الأنابيب. قم بتجميد الإنزيم المنقى بسرعة، وتجنب دورات التجميد والإذابة غير الضرورية. بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في هذا المجال لتحديد تقاربات الارتباط وأنشطة الهيليكاز لهذا البروتين بدقة تجاه مجموعة واسعة من ركائز DNA و RNA.

يمكن تكييف هذه الطريقة أيضاً لتنقية إنزيمات الأحماض النووية الأخرى المعتمدة على ATP والتي لا يعود فيها ناتج التفاعل الإنزيمي ركيزة مرتبطة بالإنزيم.