كامل خلية التصحيح المشبك تسجيلات لتحديد الكهربية من أيون الانتقائية في تشانلرودوبسينز

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد انتقائية الكلوريد للقنوات الأيونية الجديدة ذات البوابات الضوئية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في الفيزياء الحيوية للقناة رودوبسين مثل اتساع التيار الضوئي والحركية وانتقائية الأيونات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القراءة المباشرة لنشاط القناة الفيزيائية الحيوية التي تكون سريعة وسهلة التكرار.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن كل خطوة من خطوات الإجراء التجريبي من إعداد خلايا HEK إلى تسجيل التيارات الضوئية يجب تحسينها. سيتم عرض البذر وتقطيع خلايا HEK بواسطة Altina Klein. لبدء هذا الإجراء ، قم بوزن المكونات الصلبة ل 100 مل من المحاليل داخل الخلايا و 500 مل من المحاليل المخزنة خارج الخلية في أكواب منفصلة.

ثم أضف الكمية الخاصة من حلول المخزون المعدة. بعد ذلك ، أضف الماء عالي النقاء واضبط الرقم الهيدروجيني بعناية باستخدام الأحماض والقواعد. ثم اضبط الأسمولية مع الجلوكوز على 290 مللي أوسمول و 320 مللي أوسمول للمحاليل داخل الخلايا وخارجها ، على التوالي.

في هذا الإجراء ، ضع ما يصل إلى ثلاثة زلات من الزجاج المطلي بالليسين جنبا إلى جنب في طبق بتري مقاس 35 ملم. ثم قم بزرع 1.5 مرة 10 إلى خلايا HEK الخامسة في ملليلترين من DMEM القياسي مع 10٪ FBS وريكينول ميكرومولار واحد في كل طبق. لنقل الخلايا لكل طبق ، قم بإعداد محلول مكون من ميكروغرامين من الحمض النووي البلازميد في 250 ميكرولتر من DMEM بدون FBS وستة ميكرولترات من كاشف التعداد.

بعد 15 دقيقة من الحضانة ، أضف المحلول برفق إلى الخلايا. قبل القياس، اسحب بعض ماصات التصحيح منخفضة المقاومة باستخدام مجتذب الماصات الدقيقة وقم بتلميعها بالنار. قم بتخزين الماصات في وعاء خال من الغبار ليوم القياس.

قبل 30 دقيقة من التسجيلات ، قم بتشغيل جميع مكونات الإعداد للتسخين إلى درجة حرارة العمل. تأكد من أن المخازن المؤقتة في درجة حرارة الغرفة. للبدء ، أغلق غرفة القياس بالسيليكون لمنع تسرب المخزن المؤقت الخارجي.

ثم ضع غطاء واحد في الغرفة وأغلقه. املأ الغرفة بعناية بمخزن مؤقت خارج الخلية لمنع الخلايا من الانفصال. قم بتخزين طبق بتري مع شرائح غطاء أخرى في حاضنة للمجموعة التالية من التجارب.

ثم ضع غرفة القياس تحت المجهر باستخدام هدف 40X لتصور الخلية. بعد ذلك ، ضع جسر اوجير فوق قطب الحمام وضعه في الغرفة مع مستشعر مستوى السائل ومخرج التروية لمعالج الحمام. استبدل المحلول خارج الخلية مرتين بملليلتر واحد من المحلول الخارجي الطازج لإزالة وسط الثقافة المتبقي والخلايا المنفصلة.

اجعل الخلايا في بؤرة التركيز وابحث عن خلية منقولة تحتاج إلى عزلها عن الخلايا الأخرى. ثم استخدم مجموعة مرشحات ثلاثية النطاق وضوء برتقالي لإثارة mCherry وتصوره. بعد ذلك، املأ إحدى الماصات المسحوبة بالمحلول داخل الخلايا.

وقم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق قلب الماصة عدة مرات. بعد ذلك ، قم بتركيب الماصة على حامل الماصة وقم بالضغط الإيجابي لمنع انسداد الأطراف. حدد موقع طرف الماصة اللاصقة أسفل المجهر وانتقل بالقرب من الخلية باستخدام المعالج الدقيق.

ضمن برنامج الحصول على البيانات ، ابدأ اختبار الغشاء في وضع الحمام وقم بتطبيق خطوة الجهد. تحقق مما إذا كانت مقاومة الماصة في النطاق المطلوب من 1.3 إلى 3.0 ميغا أوم. ثم قم بتصفير تيارات الإزاحة واضبط إمكانات الماصة عن طريق تدوير مقبض إزاحة الماصة على مكبر الصوت.

لإنشاء رقعة في تكوين الخلية بأكملها، اقترب ببطء من الخلية باستخدام ماصة التصحيح من الأعلى وحرر الضغط الإيجابي قبل لمس الخلية مباشرة. في بعض الأحيان يشكل التكوين المرتبط بالخلية نفسه بعد ذلك. بعد الاقتراب من الخلية ، قم بتغيير اختبار الغشاء من وضع الحمام إلى وضع التصحيح.

قم بتعويض سعة الماصة عن طريق تدوير مقبض تعويض سعة الماصة للحصول على استجابة مسطحة لنبضة الاختبار. قم بتبديل اختبار الغشاء إلى وضع الخلية. ثم قم بتمزيق الرقعة دون تدمير الختم عن طريق تطبيق نبضات قصيرة من الضغط السلبي أو الضغط السلبي مع زيادة القوة للحصول على تأكيد الخلية بأكملها.

ابدأ تعويض مقاومة السلسلة عن طريق تعيين معلمتي الخلية الكاملة ، سعة الخلية ومقاومة السلسلة. في لوحة تعويض المقاومة المتسلسلة ، قم بتشغيل التنبؤ والتصحيح بنسبة تصل إلى 90٪ ثم قم بتشغيل مفتاح تعويض الخلية بأكملها واضبط معلمات الخلية بأكملها بطريقة تكرارية للحصول على استجابة ختم اختبار مسطحة بشكل مثالي. بعد إنشاء تكوين الخلية بأكملها، انتظر دقيقتين على الأقل قبل التسجيل لضمان الاستبدال الكافي للمحلول داخل الخلايا من خلال ماصة الرقعة.

سجل التيارات التي يسببها الضوء عند إمكانات احتجاز مختلفة. بعد ذلك ، قم بتبادل المخزن المؤقت خارج الخلية إلى كلوريد منخفض في الغرفة خمس مرات على الأقل دون تدمير الرقعة وتسجيل علاقة جهد تيار أخرى بتركيز الكلوريد الجديد. يوضح هذا الشكل أنه أثناء الإضاءة بالضوء الأخضر ، يتميز PsACR1 بتيار عابر سريع يتحلل بسرعة إلى مستوى تيار ثابت.

بعد إطفاء الضوء ، تتحلل التيارات الضوئية إلى الصفر في غضون أجزاء من الثانية. يؤدي تقليل تركيز الكلوريد خارج الخلية إلى القضاء تماما على التيارات الضوئية الموجهة إلى الخارج. يؤدي تبادل تركيز الكلوريد خارج الخلية إلى تحول في إمكانات الانعكاس التي يمكن استنتاجها من مخطط الجهد الحالي.

يحدد تقييم إمكانات الانعكاس من قياسات متعددة التحول الدراماتيكي لإمكانات الانعكاس الناجم عن تباين تركيز الكلوريد الخارجي. اللافت للنظر أن إمكانات الانعكاس المقاسة تتوافق بشكل مباشر مع إمكانات Nernst المحسوبة للكلوريد مما يؤكد انتقائية الكلوريد العالية ل PsACR1. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للتيارات الضوئية التي يسببها الضوء على خلايا HEK التي تعبر عن channelrhodopsin.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء الإجراء بأكمله في أربعة أيام بينما يستغرق تسجيل التيارات الضوئية عدة ساعات. استكمالا لهذا الإجراء ، يمكن إجراء الطفرات الموجهة في الموقع والطرق الطيفية لتوضيح السمات الهيكلية والآليات الخلوية للقنالرودوبسين. مهد التوصيف والهندسة الجزيئية ل channelrhodopsin الطريق للباحثين في علم الأعصاب للتلاعب باستثارة الخلايا العصبية المختارة بالضوء.