الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من في المختبر الثقافات خلية

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد نشاط السيتوكروم P450s ، أو CYPs ، في الخلايا المستنبتة. CYPs هي إنزيمات رئيسية تشارك في عملية التمثيل الغذائي للأدوية والمواد السامة ولا يتم الاحتفاظ بتعبيرها في المختبر في كثير من الأحيان. غالبا ما يفقد التعبير الطبيعي لإنزيمات CYP عند زراعة الخلايا في المختبر.

لذلك ، من المحتمل أن تحد العديد من النماذج المختبرية من أهمية فهم عملية التمثيل الغذائي للأدوية والمواد السامة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي بساطتها عند تقييم نشاط CYP في الخلايا المستزرعة. باستخدام ركائز ومثبطات المسبار ، يتم تقديم منصات مختلفة للقياس الكمي ، بما في ذلك قياس الطيف الكتلي.

للبدء ، احصل على قوارير مبردة بخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. يستخدم البروتوكول المقدم خط الخلايا الكبدية كمثال. أثناء العمل في ظروف معقمة ، افتح القارورة المبردة بعناية لتحرير أي ضغط زائد ، ثم قم بسحب محتويات القارورة المبردة في أنبوب سعة 10 مليلتر مملوء بتسعة ملليلتر من وسط Williams'E الدافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية.

الطرد المركزي المحلول لمدة 10 دقائق عند 400 مرة جم في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط الذوبان الخاص ، وتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية واستكماله بالجلوتامين. بعد حساب الخلايا القابلة للحياة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بزرع الخلايا في صفيحة مطلية بالكولاجين 24 بئر بكثافة 60،000 خلية قابلة للحياة لكل بئر وحجم نهائي قدره 0.5 مل من وسط الذوبان.

بعد بضعة أيام في الثقافة ، تشكل الخلايا بنية تربيقية تحت التقاط. عادة ما يتم ملاحظة النشاط الأيضي الأمثل بين الأيام السابعة والعاشرة ، ويكون أدنى مستوى في اليوم الرابع. لتحضير مزارع ظهارة مجرى الهواء المتمايزة ، استخدم ظهارة مجرى الهواء الأولية المتمايزة بالكامل المتوفرة تجاريا والتي نمت في واجهة الهواء السائل على إدخال.

باستخدام ملاقط معقمة ، قم بإزاحة الخلية برفق من مصفوفة الاغاروز ونقلها إلى اللوحة الجديدة المحملة مسبقا ب 700 ميكرولتر من وسط الاستزراع الخاص. قم بتقييم سلامة أنسجة مجرى الهواء باستخدام الطرق المشار إليها في بروتوكول النص ، مثل مقاومة الظهارة أو تردد نبض الأهداب. قبل التجربة ، قم بإعداد سلسلتين من إدخالات الخلايا لخلايا مجرى الهواء والآبار للخلايا الكبدية بحد أدنى ثلاث مكررات.

استخدم سلسلة واحدة لتجربة التثبيط والأخرى لمسبار التمثيل الغذائي فقط. قم بإعداد سلسلة ثالثة من الخلايا كعنصر تحكم فارغ للوسائط. في يوم التجربة ، استبدل وسط زراعة الخلايا ب 450 ميكرولتر من الوسط الطازج.

أضف 50 ميكرولترا من الوسط الذي يحتوي على مثبط CYP 10x إلى سلسلة الخلايا المعدة لتجربة التثبيط واحتضانها مسبقا لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استبدل الوسيط في سلسلة التثبيط ب 450 ميكرولتر من الوسط الطازج ، وأضف 50 ميكرولترا من الوسط الذي يحتوي على كل من مثبط CYP 10x وركيزة المسبار 10x. أضف 50 ميكرولترا من الوسط مع ركيزة المسبار 10x إلى الخلايا الأخرى ، ثم أضف كمية مكافئة من السيارة المخففة في الوسط إلى عناصر التحكم في الخلية الفارغة.

بعد احتضان الخلايا لمدة صفر إلى خمس دقائق للنقطة الزمنية الأولى ، صفر التحكم في الخلفية ، اجمع الوسيط في أنابيب منفصلة مصنفة وتجميد الوسيط للمعالجة المستقبلية. ثم احتضان خليتين للنقطة الزمنية لمدة 16 ساعة في حاضنة الخلية. في نهاية فترة الحضانة ، اجمع الوسيط باستخدام نفس الطريقة لقياس كمية المنتج الأيضي.

انقل 250 ميكرولتر من وسط الحضانة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مليلتر ، وأضف محلول مخزون قياسي داخلي 4-methylumbelliferone للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 100 نانو مولار. اضبط درجة الحموضة في الوسط إلى ما بين 4.5 و 5.0 عن طريق إضافة حمض الهيدروكلوريك مولي واحد ، ميكرولتر واحد في كل مرة. تحقق من الأس الهيدروجيني عن طريق سحب ماصتين إلى 10 ميكرولتر من الوسط على شريط الأس الهيدروجيني ، ثم أضف 150 وحدة من betaglucuronidase arylsulfatase من Helix pamatia.

بعد الحضانة لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية ، أوقف التفاعل بإضافة 250 ميكرولتر من الميثانول البارد. تبخر المذيب باستخدام جهاز طرد مركزي مفرغ عند 45 درجة مئوية. أعد تكوين العينات ب 500 ميكرولتر من محلول أسيتونيتريل 30٪ إلى الماء.

لإجراء القياس الكمي القائم على قياس الطيف الكتلي ، أضف 250 ميكرولترا من كل معيار تخفيف تسلسلي إلى قارورة زجاجية كروماتوغرافيا سائلة كهرمانية فائقة الأداء للحقن في جهاز أخذ العينات التلقائي UPLC-MS. أضف أيضا عينات الاختبار إلى قوارير UPLC الكهرمانية وضعها في جهاز أخذ العينات التلقائي UPLC. بعد التوزيع العشوائي لجميع القوارير ، قم بتشغيل UPLC-MS باستخدام الإعدادات المفصلة في بروتوكول النص اعتمادا على المسبار المحدد المراد تحديده كميا.

استخدم أداة القياس الكمي، بناء طريقة القياس الكمي في أدوات القياس الكمي لمقياس الطيف الكتلي لإنشاء منحنى المعايرة من المعيار الاصطناعي المكتسب والمعيار الداخلي، ثم استخدم معالج القياس الكمي لتحديد دفعة العينة والعينات لتحديد طريقة القياس الكمي وتنفيذها. للحث على CYP1A1 ، CYP1B1 ، استخدم تخطيط اللوحة الموجود في بروتوكول النص. احتضان الخلايا المخصصة للحث بتركيز نهائي يبلغ 10 نانومولار TCDD في وسط لمدة 72 ساعة.

بعد هذه الفترة ، قم بإزالة الوسط ، واشطف الآبار باستخدام PBS ثلاث مرات ، وأضف بعض الوسائط الطازجة. قبل احتضان الخلايا باستخدام مسبار المراسل المضيء ، قم باحتضان المجموعة الفرعية المعينة من الخلايا المستحثة مسبقا لمدة 30 دقيقة باستخدام مثبط CYP1A1 و CYP1B1 في الوسط. أضف الدعامة المضيئة ، لوسيفيرين 6'كلوروإيثيل الأثير بتركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومولار إلى الخلايا المثبطة الإضافية غير المستحثة والمستحثة والمستحثة.

احتضن لمدة أربع ساعات ثم انقل 25 ميكرولترا من وسط الاستزراع إلى صفيحة بئر بيضاء غير شفافة 96 وأضف 25 ميكرولترا من كاشف الكشف عن اللوسيفيرين الذي توفره الشركة المصنعة. بعد الحضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اقرأ اللوحة على الفور باستخدام مقياس الإلواء. يتم عرض اللمعان النسبي الناتج عن معالجة لوسيفيرين 6'كلوروإيثيل الأثير ، والذي يتم تحفيزه بواسطة CYP1A1 ، CYP1B1 ، هنا.

يظهر المثال عدم وجود نشاط إنزيمي في غياب تحريض TCDD. بعد تحريض TCDD ، لوحظ نشاط CYP1A1 و CYP1B1 في كل من أنواع الخلايا الكبدية والتنفسية. أخيرا ، إضافة مثبط CYP1A1 و CYP1B1 ألفا نافتوفلافون يقلل أو يلغي نشاط CYP.

لتقييم نشاط CYP2A6 و 2A13 في أنواع الخلايا الكبدية ومجرى الهواء ، تم قياس كمية 7-هيدروكسي كومارين الناتجة عن هيدروكسيل الكومارين بواسطة الإنزيم باستخدام UPLC LC-MS. عند صفر دقيقة من الحضانة مع الكومارين ، يتم الكشف عن الخلفية فقط. بعد 16 ساعة ، لوحظ هيدروكسيل الكومارين مع تكوين 7-هيدروكسي كومارين في نوعي الخلايا.

أخيرا ، فإن إضافة مثبط CYP2A و 2A13 يمنع تكوين 7-hydroxycoumarin. بمجرد إتقان ، يمكن إجراء أجزاء حضانة المسبار والقياس الكمي لهذه التقنية في غضون ساعات قليلة إلى يوم واحد في معظم الحالات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحوصات التمثيل الغذائي المختلفة للمرحلة الأولى باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا ، مما يؤكد خصوصية الإنزيم باستخدام التثبيط و / أو الحث حسب الحاجة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن أنواع الخلايا المختلفة قد تتطلب أوقات حضانة أطول ، ومن الضروري تضمين نوع خلية يمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي. لا تنس أن العمل مع TCDD يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل معدات الحماية الشخصية الكاملة أثناء تنفيذ هذا الإجراء. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو استخدام نماذج مختبرية مناسبة للتقييم قبل السريري للأدوية الجديدة وتقييمات مخاطر المواد الكيميائية والمكونات المستخدمة في المنتجات الاستهلاكية.