الطيف الكتلي والنهج القائم Luminogenic للتميز المرحلة الأولى الاستقلابية الكفاءة من

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد نشاط سيتوكروم P450s، أو CYPs، في الخلايا المستنبتة. وتُعد CYPs إنزيمات رئيسية تشارك في استقلاب الأدوية والمواد السامة، وغالباً ما لا يتم الحفاظ على تعبيرها في المختبر. ففي كثير من الأحيان، يُفقد التعبير الطبيعي لإنزيمات CYP عند استنبات الخلايا في المختبر.

وبناءً على ذلك، فإن العديد من النماذج المختبرية قد تحد من القدرة على فهم استقلاب الأدوية والمواد السامة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في بساطتها عند تقييم نشاط إنزيمات CYP في الخلايا المستنبتة. ومن خلال استخدام الركائز المسبارية والمثبطات، يتم عرض منصات تقدير كمي مختلفة، بما في ذلك قياس طيف الكتلة.

للبدء، احصل على أنابيب تجميد تحتوي على الخلايا كما هو موضح في البروتوكول النصي. يستخدم البروتوكول المقدم خطاً خلوياً كبدياً كمثال. وأثناء العمل تحت ظروف معقمة، افتح أنبوب التجميد بحذر لتنفيس أي ضغط زائد، ثم انقل محتويات أنبوب التجميد باستخدام الماصة إلى أنبوب سعة 10 milliliter مملوء بـ تسعة milliliters من وسط Williams'E الذي تم تدفئته مسبقاً عند 37 degrees Celsius.

قم بطرد المحلول مركزياً لمدة 10 دقائق عند 400 ×g في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من السائل الطافي، أعد تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من وسط الإذابة المملوك للشركة، المسخن مسبقاً إلى 37 °C والمُدعم بالجلوتامين. بعد عد الخلايا الحية كما هو موضح في البروتوكول النصي، ازرع الخلايا في طبق مكون من 24 بئراً ومطلي بالكولاجين بكثافة 60,000 خلية حية لكل بئر وبحجم نهائي قدره 0.5 ملليلتر من وسط الإذابة.

بعد بضعة أيام من الزرع، تُشكل الخلايا بنية تربيقية غير متلاحمة. وعادةً ما يُلاحظ أن النشاط الأيضي يكون في أقصى مستوياته بين اليومين السابع والعاشر، ويكون في أدنى مستوياته في اليوم الرابع. ولتحضير مزارع الظهارة التنفسية المتمايزة، استخدم ظهارة تنفسية أولية متمايزة تماماً ومتوفرة تجارياً، تم إنماؤها عند الواجهة الهوائية السائلة على قطعة إدراج (insert).

باستخدام ملقط معقم، قم بإخراج قطعة إدخال الخلايا برفق من مصفوفة الأجاروز وانقلها إلى طبق جديد محمل مسبقاً بـ 700 microliters من وسط زراعي مسجل الملكية. قم بتقييم سلامة نسيج الممرات الهوائية باستخدام الطرق المشار إليها في البروتوكول النصي، مثل المقاومة عبر الظهارية أو تردد ضربات الأهداب. قبل بدء التجربة، قم بتحضير سلسلتين من قطع إدخال الخلايا لخلايا الممرات الهوائية وآبار لخلايا الكبد مع ما لا يقل عن ثلاث مكررات.

استخدم سلسلة واحدة لتجربة التثبيط والسلسلة الأخرى للمجس الأيضي فقط. قم بتحضير سلسلة ثالثة من الخلايا كضابط فراغ للوسط. في يوم التجربة، استبدل وسط استزراع الخلايا بـ 450 microliters من وسط جديد.

أضف 50 µL من الوسط الذي يحتوي على مُثبط CYP بتركيز 10x إلى مجموعة الخلايا المُعدة لتجربة التثبيط، واتركها في حضانة أولية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، استبدل الوسط في مجموعة التثبيط بـ 450 µL من وسط طازج، وأضف 50 µL من الوسط الذي يحتوي على كل من مُثبط CYP بتركيز 10x والركيزة المسبارية بتركيز 10x. أضف 50 µL من الوسط الذي يحتوي على الركيزة المسبارية بتركيز 10x إلى الخلايا الأخرى، ثم أضف كمية مكافئة من المذيب المخفف في الوسط إلى ضوابط الخلايا الفارغة.

بعد تحضين الخلايا لمدة تتراوح من صفر إلى خمس دقائق للنقطة الزمنية الأولى، وهي ضابط الخلفية صفر، يتم جمع الوسط في أنابيب منفصلة وموسومة، ثم يتم تجميد الوسط لمعالجته لاحقاً. بعد ذلك، يتم تحضين خلايا النقطة الزمنية الثانية لمدة 16 ساعة في حاضنة الخلايا. وفي نهاية فترة التحضين، يتم جمع الوسط باستخدام الطريقة نفسها لتقدير كمية المنتج الأيضي.

انقل 250 µL من وسط الحضن إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 mL، وأضف المحلول المخزون للمعيار الداخلي 4-methylumbelliferone للوصول إلى تركيز نهائي قدره 100 nM. اضبط pH الوسط ليكون بين 4.5 و 5.0 عن طريق إضافة HCl بتركيز 1 M، بمقدار 1 µL في كل مرة. تحقق من الـ pH عن طريق سحب من 2 إلى 10 µL من الوسط ووضعها على شريط قياس الـ pH، ثم أضف 150 وحدة من betaglucuronidase arylsulfatase المستخلص من Helix pamatia.

بعد الحضانة لمدة ساعة واحدة عند 37 °C، أوقف التفاعل بإضافة 250 µL من الميثانول البارد. قم بتبخير المذيب باستخدام جهاز طرد مركزي تفريغي عند 45 °C. أعد تكوين العينات باستخدام 500 µL من محلول أسيتونيتريل بتركيز 30% في الماء.

لإجراء التقدير الكمي القائم على قياس الطيف الكتلي، أضف 250 microliters من كل معيار تخفيف تسلسلي إلى قارورة زجاجية كهرمانية مخصصة للكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء من أجل الحقن في جهاز أخذ العينات التلقائي UPLC-MS. أضف أيضاً عينات الاختبار إلى قارورات UPLC كهرمانية وضعها في جهاز أخذ العينات التلقائي UPLC. بعد توزيع القارورات بشكل عشوائي، قم بتشغيل جهاز UPLC-MS باستخدام الإعدادات المفصلة في البروتوكول النصي اعتماداً على المسبار المحدد المراد تقديره كمياً.

استخدم أداة Quantitate, Build Quantitation Method ضمن أدوات تقدير الكمية في مطياف الكتلة لإنشاء منحنى المعايرة من المعيار الاصطناعي والمعيار الداخلي المكتسبين، ثم استخدم معالج التقدير الكمي (Quantitation Wizard) لتحديد دفعة العينات والعينات المراد تقدير كميتها وتنفيذ طريقة التقدير الكمي. لتحفيز CYP1A1 و CYP1B1، استخدم تخطيط الطبق الموضح في البروتوكول النصي. قم بحضن الخلايا المخصصة للتحفيز بتركيز نهائي قدره 10 nanomolar من TCDD في الوسط لمدة 72 ساعة.

بعد هذه الفترة، قم بإزالة الوسط، واشطف الآبار بمحلول PBS ثلاث مرات، ثم أضف بعض الوسط الطازج. وقبل تحضين الخلايا مع مسبار التقرير المضيء، قم بتحضين المجموعة الفرعية المحددة من الخلايا المُحفَّزة مسبقاً لمدة 30 دقيقة مع مثبط CYP1A1 و CYP1B1 في الوسط. أضف المسبار المضيء، luciferin 6'chloroethyl ether بتركيز نهائي قدره 50 micromolar إلى الخلايا غير المُحفَّزة، والخلايا المُحفَّزة، والخلايا المُحفَّزة مع المثبط.

يتم التحضين لمدة أربع ساعات، ثم يُنقل 25 µL من وسط المزرعة إلى طبق أبيض معتم يحتوي على 96 بئراً، ويُضاف 25 µL من كاشف الكشف عن اللوسيفيرين المورد من قبل الشركة المصنعة. وبعد التحضين لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تُقرأ لوحة الاختبار فوراً باستخدام مقياس اللومينومتر. ويتم هنا عرض التألق النسبي الناتج عن إزالة الألكيل من إيثر 6'كلورو إيثيل اللوسيفيرين، والذي يتم تحفيزه بواسطة CYP1A1 و CYP1B1.

تُظهر العينة عدم وجود نشاط إنزيمي في غياب تحفيز TCDD. وبعد التحفيز بـ TCDD، يُلاحظ نشاط CYP1A1 وCYP1B1 في كل من أنواع الخلايا الكبدية والتنفسية. وأخيرًا، يؤدي إضافة مثبط CYP1A1 وCYP1B1، وهو alpha-naphthoflavone، إلى تقليل نشاط CYP أو القضاء عليه.

لتقييم نشاط CYP2A6 و 2A13 في أنواع الخلايا الكبدية وخلايا الممرات الهوائية، تم قياس كمية 7-hydroxycoumarin الناتجة عن عملية هيدروكسيلة الكومارين بواسطة الإنزيم باستخدام تقنية UPLC LC-MS. عند الدقيقة صفر من الحضن مع الكومارين، يتم اكتشاف الخلفية فقط. وبعد مرور 16 ساعة، لوحظت هيدروكسيلة الكومارين مع تكوين 7-hydroxycoumarin في نوعي الخلايا.

وأخيراً، تمنع إضافة مثبط CYP2A, 2A13 تكوين 7-hydroxycoumarin. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمام جزئي تحضين المسبار والتقدير الكمي خلال بضع ساعات وصولاً إلى يوم كامل في معظم الحالات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إجراء فحوصات استقلاب المرحلة الأولى المختلفة باستخدام أنواع مختلفة من الخلايا، مع تأكيد خصوصية الإنزيم باستخدام التثبيط و/أو التحفيز حسبما تقتضي الحاجة.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن أنواع الخلايا المختلفة قد تتطلب فترات تحضين أطول، ومن الضروري تضمين نوع من الخلايا يمكن استخدامه كضابط موجب. لا تنسَ أن العمل مع TCDD يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية الكاملة، أثناء تنفيذ هذا الإجراء. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل استخدام نماذج ملائمة في المختبر (in vitro) للتقييم قبل السريري للأدوية الجديدة وتقييم مخاطر المواد الكيميائية والمكونات المستخدمة في المنتجات الاستهلاكية.