فحص البروتين كيناس النشاط مع راديولابيلد أتب

الهدف العام من هذا الاختبار هو قياس النشاط الأنزيمي لكينازات البروتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات كيناز ، مثل مدى نشاط طفرة كيناز أو كيناز ، وخصوصيته ، وما إذا كان نشاطه حساسا لعلاجات الخلايا المختلفة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها متعددة الاستخدامات وكمية.

سيوضح هذا الإجراء ستيف ستيبيك ، عالم الأبحاث في مختبر كوب الذي لديه خبرة كبيرة في هذا الفحص. للبدء ، أضف ميكرولترين من ملليغرام واحد لكل مليلتر من الجسم المضاد إلى 200 ميكرولتر من محللات الخلايا واحتضانها عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة أثناء التأرجح. اغسل حبات البروتين A-Sepharose مرتين إلى ثلاث مرات عن طريق إضافة محلول التحلل ثم المس الغزل عند أربع درجات مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة عند 5000 مرة جم ، ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وأعد تعليق الخرزات في المخزن المؤقت.

بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولترا من الملاط بنسبة 50٪ من حبات البروتين A-Sepharose ومخزن التحلل إلى المحلل. احتضان المحللات عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة أثناء التأرجح. اللمس تدور عند أربع درجات مئوية لحبيبات الخرز وإزالة المادة الطافية.

اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من المخزن المؤقت لغسل الخرزة ، متبوعا بالدوران باللمس ، ثم اغسل الخرزات مرة واحدة باستخدام مخزن مؤقت لتفاعل X kinase. بعد الدوران باللمس ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المخزن المؤقت دون إزالة الخرز. لتهيئة المقايسة ، أضف خليط التفاعل بالكامل إلى عينة الكيناز.

احتضان التفاعل عند 30 درجة مئوية لمدة خمس دقائق إلى ساعة واحدة اعتمادا على نشاط الكيناز الذي يتم فحصه. أوقف التفاعل عن طريق وضعه على الجليد وإضافة 7.5 ميكرولتر من خمسة عينات عازلة X Laemmli ، ثم قم بتسخين التفاعل عند 100 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في الكتلة الحرارية. بعد لمس تدوير العينة ، قم بتحميل 20 ميكرولترا لكل بئر على جل SDS-PAGE من 10 إلى 15٪.

تأكد من الحفاظ على جهاز الجل محميا للحد من التعرض للفوسفور -32 لأنه باعث بيتا عالي الطاقة. قم بتشغيل الجل لفترة كافية لفصل الكيناز والركيزة. بعد الجري ، قم بإزالة الجل من ألواح الزجاج والألمنيوم ، ثم ضع الجل في 50 مل من صبغة Coomassie لمدة ساعة واحدة على شاكر مداري مضبوطة على 50 دورة في الدقيقة.

في هذه الخطوة ، استخدم حاوية أكبر قليلا من الجل نفسه. لإزالة الجل ، انقله من البقعة إلى محلول التثبيت. ضع قطعا من الرغوة أو مناديل المختبر المعقودة في الحاوية مع الجل لامتصاص صبغة Coomassie.

هز الجل في 600 إلى 700 مل من محلول التثبيت طوال الليل على شاكر مداري بسرعة 50 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، قم بإزالة الجل من محلول التثبيت وانقعه في 200 مل من الميثانول لمدة دقيقة إلى دقيقتين مع تحريك لطيف حتى يتحول الجل إلى اللون الأبيض اللبني. سيساعد ذلك على منع التشقق أثناء خطوة التجفيف.

بعد ذلك ، بلل قطعة من ورق الترشيح النوعي بحجم 14 سم × 14 سم تقريبا بالميثانول وضعها على مجفف فراغ هلام. ضع الجل لأسفل على ورق الترشيح ، بحيث يكون الجانب الأمامي متجها لأعلى. قم بتغطية الجل بعناية بغلاف بلاستيكي ، ثم قم بتشغيله وتشغيله وقم بتطبيق المكنسة الكهربائية.

بمجرد الحصول على الفراغ بعد بضع ثوان فقط ، قم بتدوير فقاعات الهواء باستخدام براير مطاطي ناعم. استمر في الجري لمدة 90 دقيقة. قم بإزالة الجل المجفف وقم بتوصيل علامة autorad ، مثل المسطرة الفسفورية أو النقطة بورق الترشيح الموجود على جانب الجل وضعها في علبة تحتوي على شاشة مكثفة.

استخدم عداد جيجر للتحقق من شدة الإشارة. بالنسبة للإشارات الأضعف ، سيؤدي التعرض عند 70 درجة مئوية تحت الصفر إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر مع شاشة مكثفة إلى زيادة كثافة نطاق الفيلم. في غرفة مظلمة ، ضع قطعة من الفيلم فوق الجل المجفف داخل كاسيت الفيلم الذي يحتوي على شاشة مكثفة.

إذا كان عدد التكلفة لكل ألف ظهور 100 أو أقل ، فجرب التعرض الليلي عند 70 إلى 80 درجة مئوية تحت الصفر. بدلا من ذلك ، إذا كان العدد أقرب إلى 10،000 ، فابدأ بالتعرض لمدة ساعة واحدة وقم بالتحسين من هناك. في ختام التعرض ، قم بإزالة الفيلم قبل تطويره في معالج أفلام طبي أو معالج الأشعة السينية.

ضع علامة على العصابات المقابلة لمعايير البروتين على الفيلم. أيضا ، قم بتسمية معايير البروتين وممرات التفاعل للرجوع إليها في المستقبل. استئصال العصابات من الجل التي تتوافق مع العصابات ذات الأهمية في الفيلم.

ضع العصابات في قوارير تلألؤ سعة سبعة ملليلتر وأضف أربعة ملليلتر من سائل التلألؤ. عد العصابات بعداد التلألؤ السائل. تأكد من ضبط العداد لمراقبة نافذة طيف الطاقة الصحيحة للفوسفور -32.

تابع تحليل النتائج كما هو موضح في بروتوكول النص. تم استخدام كسور ERK2 المنقاة في مقايسة كيناز مع MBP في وجود أو عدم وجود MEK1R4F ، وهو محفز نشط بشكل أساسي لنشاط كيناز ERK2. في تجربة مماثلة ، تم استخدام اختبار MBP kinase لقياس نشاط طفرات ERK2 المؤتلفة المنقاة من الثقافات البكتيرية بالنسبة للبروتين من النوع البري.

على الرغم من أن ERK2 كان قادرا على فسفرة MBP عند تحفيزه بواسطة MEK1R4F ، إلا أن نشاط كيناز ERK2 يتم إلغاؤه بشكل كبير عن طريق طفرة إما في اللايسين التحفيزي أو الثريونين القريب من المواقع الكنسية للفسفرة المزدوجة. يعرض ERK2 T188D و ERK2 T188E نشاط كيناز هامشي تجاه ببتيد صغير مرن. ومع ذلك ، فهي غير قادرة على فسفرة ركائز ERK2 المعروفة ، Nup153 و PDX1 ، كما هو موضح في النوع البري ERK2.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يوم إلى يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام ATP المصنف بالإشعاع لفحص نشاط كينازات البروتين لفهم شبكات الإشارات التي توجد فيها بشكل أفضل. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تحسين بروتوكول الترسيب الأميني لسحب الكينازات ذات الأهمية لحساب كميات البروتين المتساوية وقياس تركيزات البروتين المؤتلف لضمان مقارنات دقيقة لنشاط كيناز.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إشارات الخلايا لاستكشاف مسارات نقل محددة وأدوارها في تنظيم التماثل بالإضافة إلى مساهماتهم في تطور المرض. لا تنس أن العمل مع المواد المشعة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء معدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.