منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقوش الخلايا أو الركائز عن طريق توزيعها في قنوات دقيقة معقدة وطويلة ومغلقة باستخدام أدوات بسيطة على مقاعد البدلاء متوفرة في معظم المختبرات البيولوجية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء فيما يتعلق بالتفاعلات من خلية إلى خلية ومن خلية إلى بروتين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سهلة الأداء ولا تتطلب سوى أدوات متوفرة بسهولة في معظم المختبرات البيولوجية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب تحسين ظروف الحضانة للخلايا والركائز التي يختارها الباحث. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث أن الموضع الصحيح لختم PDMS والحل يحسن بشكل كبير من قابلية تكرار التجربة. ابدأ برسم تخطيط القناة المصغرة باستخدام أداة رسم CAD.

ثم اطبع الرسم على ورق أبيض. بعد ذلك ، استخدم الأيزوبروبانول لتنظيف شريحة زجاجية كبيرة بما يكفي لاستيعاب التصميم. ثم جفف الشريحة بمسدس هوائي.

قم بتوصيل شريط لاصق بالشريحة الزجاجية التي تم تنظيفها ، مع الحرص على عدم حبس أي فقاعات هواء. بعد ذلك ، قم بلصق جوانب الشريحة الزجاجية على الورق بالتصميم ، بحيث يكون جانب الشريط متجها لأعلى. استخدم مشرطا لقص الشريط اللاصق على الشريحة الزجاجية ، باستخدام تصميم الورق كمرجع.

بمجرد القطع ، انزع الشريط من المناطق غير المرغوب فيها من الشريحة الزجاجية. بعد ذلك ، اشطف الشريحة الزجاجية بالأيزوبروبانول لإزالة أي مادة لاصقة متبقية. ثم استخدم مسدس هوائي لتجفيف السطح.

بمجرد زخرتها وتنظيفها ، تخبز الشريحة الزجاجية في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بلف الشريط برفق باستخدام أسطوانة مطاطية ، لإزالة فقاعات الهواء والسماح للشريحة بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة في طبق بتري. ابدأ بخلط 10 أجزاء من المطاط الصناعي PDMS مع جزء واحد من عامل المعالجة الخاص به وحرك الخليط بقوة.

ثم ضع الخليط في غرفة مفرغة لإزالة الغازات من الخليط حتى تختفي فقاعات الهواء. صب طبقة بسمك 2 مم من الخليط على قالب الشريط اللاصق ، وقم بإزالة الغاز من القالب حتى تختفي جميع فقاعات الهواء. بمجرد أن تبرد ، استخدم مشرطا لقطع طبقة PDMS على بعد 5 مم على الأقل من الميزات.

وبعد ذلك ، قم بتقشير PDMS المعالج من القالب باستخدام زوج من الملقط. قم بعمل ثقب مدخل واحد بكمة خزعة 1 مم ، ويفضل أن يكون ذلك في نهاية شبكة من القنوات الدقيقة. بعد ذلك ، قم بتنظيف قالب PDMS بشريط لاصق لإزالة جزيئات الغبار من الجهاز.

تعقيم جهاز القناة الدقيقة PDMS عن طريق شطفه بمحلول 70٪ إيهتانول ، متبوعا بماء معقم منزوع الأيونات ، وتعريضه للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة. استخدم الملقط لوضع PDMS المعقم المصبوب على زلة غطاء زجاجي معقم ، واضغط برفق باستخدام طرف الملقط. بعد ذلك ، ضع قطرة من بولي د ليسين في المخزن المؤقت رباعي الصوديوم على مدخل القنوات الدقيقة.

ضع طبق بتري تحت المكنسة الكهربائية لمدة 10 دقائق. خلال هذا الوقت ، لاحظ الهواء الخارج من القناة على شكل فقاعات. حرر الفراغ ولاحظ تدفق محلول الركيزة إلى القناة الدقيقة احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد ذلك ، انزع ختم PDMS بعناية باستخدام ملاقط معقمة ، واغسل النمط ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. أضف محلول BSA بنسبة 1٪ إلى زلة الغطاء الزجاجي ، لتقليل الالتصاق غير المحدد ، واحتضان العينة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استنشق حل BSA.

لبدء الزخرفة غير المباشرة للخلايا ، قم بإعداد تعليق الخلية في وسط مزرعة خالية من المصل كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. أضف تعليق الخلية إلى طبق بتري المزخرف ، وغمر المنطقة المزخرفة بالكامل في تعليق الخلية. بعد ذلك ، احتضن طبق بتري عند 37 درجة مئوية في حاضنة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بالركيزة المزخرفة.

بعد الحضانة ، قم بسحب معلق الخلية الزائد من طبق بتري واغسل الخلايا المزخرفة ثلاث مرات باستخدام PBS ، مع رجها برفق لمدة عشر ثوان لإزالة الخلايا غير المتصلة. بعد ذلك ، أضف وسيط الثقافة المناسب إلى مزارع الخلايا المزخرفة ، واحتضان الخلايا المزخرفة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مخزنة بثاني أكسيد الكربون. من أجل الزخرفة المباشرة للخلايا ، أولا ، قم بتعقيم جهاز الموائع الدقيقة عن طريق شطفه بمحلول 70٪ من الإيثانول متبوعا بالماء منزوع الأيونات.

بعد ذلك ، انقع الجهاز طوال الليل في محلول 1٪ BSA لمنع التصاق الخلايا غير المحددة ب PDMS. جفف الجهاز في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتثبيته في الجزء السفلي من طبق بتري المعالج بزراعة الأنسجة. ضع 4 إلى 8 ميكرولترات من تعليق الخلية ، وهو ما يكفي لملء القنوات الدقيقة ، على المدخل ، مع تغطية الفتحة بالكامل.

ثم ضع طبق بتري في غرفة مفرغة لمدة 10 دقائق. حرر الفراغ ولاحظ تدفق تعليق الخلية إلى القناة الدقيقة. احتضن طبق بتري عند 37 درجة مئوية في حاضنة مخزن بثاني أكسيد الكربون لمدة تصل إلى ساعة واحدة.

ثم أخرج الطبق من الحاضنة واستخدم زوجا من الملقط لتقشير PDMS بعناية من الطبق. اغسل النموذج باستخدام PBS ، ثم أضف وسائط زراعة الخلايا إلى طبق بتري. عند الانتهاء ، ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة.

تظهر هنا الخلايا العصبية القشرية للفئران الجنينية منقوشة على أسطح بولي د ليسين واللامينين. يظهر موقع الخلايا الالتصاق العام بالمناطق المزخرفة والنمو على طول خطوط PDL واللامينين. تظهر هنا ، بتكبير أعلى ، الخلايا العضلية C2C12.

يلتصق هذا النوع من الخلايا أيضا بالمناطق المزخرفة ويوضح الاندماج في الأنابيب العضلية متعددة النواة. تم تكييف هذه التقنية أيضا للزخرفة المباشرة للخلايا ، كما هو موضح هنا مع الخلايا الليفية. طريقة الزخرفة المباشرة للخلايا ليس لها أي تأثير سلبي على بقاء الخلية.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الفحص المجهري الفلوري من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتضمن توطين البروتين أو تفاعلات الخلايا والركيزة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الوضع المناسب لقطرة الخلايا أو محلول الركيزة لتغطية البطانة بأكملها أمر بالغ الأهمية للنجاح. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأعصاب لاستكشاف التوجيه المحوري للمستقبلات الضوئية في بيولوجيا الشبكية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم الخلايا والركيزة باستخدام أجهزة الموائع الدقيقة PDMS المنفذة للغاز باستخدام الضغط السلبي. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجربتك.