الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

الهدف العام من هذه التجربة هو توفير طريقة فعالة وسهلة التفسير للكشف عن التوطين الخلوي تحت الخلوي واستيعاب بروتينات اندماج GPCR المعبر عنها في خلايا الثدييات. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال توطين البروتين تحت الخلوي ، مثل استيعاب المستقبلات وإعادة تدويرها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدامها بسهولة وكفاءة.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة في مراقبة GPCRs وتحديد موقعها. ويمكن أن ينطبق أيضا على أنظمة أخرى ، مثل البروتين السيتوبلازمي والنووي. بعد استعادة خلايا HEK293 ومرورها وفقا لبروتوكول النص ، عندما تنمو الخلايا بالقرب من التقاء ، تخلص من وسط النمو المتوازن ، وأضف ملليلترين من PBS ، وقم بتدوير الطبق لغسل الخلايا.

تخلص من PBS ، وأضف ملليلتر واحد من التربسين EDTA. لهضم الخلايا تماما ، قم بتدوير الطبق بعناية وشفط المحلول. ثم ضع الطبق في حاضنة C02 المغلفة بالماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

أثناء احتضان الخلايا ، قم بإعداد صفيحة من ستة آبار بإضافة ملليلترين من وسط النمو المتوازن لكل بئر. ثم ، عندما ترفع الخلايا من قاع الطبق ، أضف ملليلتر واحد من وسط النمو المتوازن إلى الطبق. امزج عن طريق سحب العينات وانقل على الفور 0.1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من صفيحة الآبار الستة المحضرة.

قم بعمل ماصة التعليق برفق في الآبار ، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. في اليوم التالي ، تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 85-95٪. بعد ذلك ، إلى أنبوبين معقمين للطرد المركزي الدقيق ، أضف ثلاثة ميكروغرامات من الحمض النووي البلازميد و 100 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى أنبوب واحد.

في هذه الأثناء ، أضف تسعة ميكرولترات من الكاشف الأول و 100 ميكرولتر من وسط المصل المخفض إلى أنبوب آخر. احتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. يمزج خليط البلازميد المخفف مع الكاشف المخفف الأول.

ثم اخلطي المحلول برفق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. استنشق وسط الخلايا وأضف 1.5 مل من DMEM الطازج بدون FBS. بعد ذلك ، أضف 215 ميكرولترا من خليط كاشف تعداء الحمض النووي إلى كل بئر ، واخلطه برفق عن طريق تحريك اللوحة.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع إلى ثماني ساعات. بعد ذلك ، استبدل الوسيط ب DMEM الطازج بنسبة 10٪ FBS. احتضان الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة أخرى قبل إجراء أي تجارب.

قد تختلف كفاءة التعداء اختلافا كبيرا في خطوط الخلايا المختلفة. لذلك ، قد يكون تحسين الجلوس والطعن في الترسيب ضروريا اعتمادا على نوع الخلية المعين المستخدم. قم بإزالة وسط النمو من لوحة ثقافة الآبار الستة.

ثم استخدم ملليلتر واحد من PBS لغسل طبقة أحادية الخلية. أضف 0.5 مل من التربسين EDTA ، وقم بتدوير الطبق ، وشفط المحلول. ثم احتضن صفيحة الثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

أثناء الحضانة ، أدخل غطاء معقم بقطر 15 ملم في كل بئر من صفيحة 12 بئر. أعد تعليق الخلايا في حجم صغير من وسط النمو الكامل الطازج ، وانقل العدد المطلوب من الخلايا إلى صفيحة 12 بئر مع أغطية. ثم احتضان الخلايا لمدة 16 إلى 24 ساعة.

بعد 16 إلى 24 ساعة من الحضانة ، عندما تنمو الخلايا بالقرب من التقاء ، أضف خمسة ميكرومولار من شبت مسبار الغشاء إلى كل بئر ، ثم ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة وسط النمو المتوازن واستخدم PBS البارد لغسل الخلايا مرتين. ثم أضف ملليلتر واحد من 4٪ PFA إلى كل بئر ، وحرك الخلايا لمدة 15 دقيقة لإصلاح الخلايا.

باستخدام PBS ، اغسل الخلايا الثابتة مرتين ، ثم أضف 200 إلى 300 ميكرولتر من DAPI إلى كل بئر ، واحتضن اللوحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل الخلايا باستخدام PBS مرتين ، قم بإزالة الغطاء بعناية من اللوحة ، وتخلص من المخزن المؤقت الزائد. اقلب الغطاء على شرائح المجهر المحملة بقطرة واحدة من وسط التركيب.

ثم قم بإزالة وسيط التثبيت الزائد من الشرائح. باستخدام الخلايا التي نمت بالقرب من التقاء ، قم بإزالة وسط النمو المتوازن وإضافة DMEM الدافئ الطازج. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة.

عالج الخلايا بتركيزات مختلفة من الترابط لمدة 30 دقيقة. وعالج الخلايا ب 10 أس سالب ستة ترابط مولي للأوقات المختلفة الموضحة هنا. استخدم PBS البارد لغسل الخلايا مرتين ، ثم أضف ملليلتر واحد من 4٪ PFA في PBS إلى كل بئر ، قبل تحريك الخلايا برفق لمدة 15 دقيقة.

بعد غسل الخلايا مرتين في PBS ، قم بإزالة الغطاء بعناية من آبار اللوحة ، وقم بتثبيتها كما هو موضح سابقا في هذا الفيديو. لإجراء الفحص المجهري متحد البؤر ، قم بتشغيل أجهزة المجهر متحد البؤر ، بما في ذلك طاقة مصباح الزئبق ، ومجهر الكمبيوتر ، والماسح الضوئي ، والليزر. قم بتشغيل البرنامج ، ثم تحقق من التكوين وحدد الليزر.

قم بتشغيل الوحدات المختلفة لنظام الفحص المجهري متحد البؤر وفقا للتعليمات. ضع شريحة معدة على مرحلة المجهر ، واستخدم وحدة التحكم في المرحلة لوضع العينة فوق العدسة الموضوعية. للحصول على عدسة غمر بالزيت ، أضف قطرة واحدة من زيت الأرز إلى الغطاء ، وقم بتوجيه الشريحة بغطاء مواجه للعدسة.

تحت التألق ، ابحث عن الخلايا ذات الأهمية ، ثم انتقل إلى وضع المسح ، واختر طاقة الليزر والنطاق الطيفي لفلوروفور الانبعاث. التقط صورا عالية الجودة عن طريق ضبط شدة الليزر والمعلمات الأخرى. يوضح هذا الشكل التعبير عن pEGFP-N1 في خلايا HEK293.

تم الكشف عن إشارة GFP في السيتوبلازم والنواة. يظهر هنا توطين تحت الخلية في خلايا HEK293 لمستقبلات الهرمونات التي تطلق موجهة الغدد التناسلية من S-Japonica ، أو SjGnRHR. مستقبلات EGFP باللون الأخضر ، وتلوين Dil ، الذي يسلط الضوء على غشاء الخلية ، باللون الأحمر.

تظهر المستقبلات في غشاء البلازما. لتصور استيعاب SjGnRHRs ، تمت معالجة الخلايا بهرمون إطلاق موجهة الغدد التناسلية بتركيزات مختلفة. كما هو موضح هنا ، استمر استيعاب المستقبلات بطريقة تعتمد على الجرعة ، وتم استيعاب المستقبل بالكامل من سطح الخلية مع 10 إلى سالب ستة ترابط مولاري.

عند علاجها ب 10 إلى سالب ستة ترابط مولي لفترات زمنية مختلفة ، كان من الممكن اكتشاف SjGnRHRs الداخلية بعد 10 دقائق من محاكاة ناهض ، وحدث الاستيعاب الشديد لمدة 60 دقيقة. كما هو موضح في خلايا HEK293 ، في كلتا التجربتين ، تم توطين بروتين اندماج SjGnRHR EGFP الفلوري بشكل أساسي في غشاء البلازما ، وتم استيعابه بشكل كبير وسريع في الخلايا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على الخلايا في الظروف المناسبة دون تلوث البكتيريا والفطريات والميكوبلازما.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل فحص الخلايا وتثبيتها من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل السؤال الثاني في المرور الخامس لمستقبلات البروتين. بعد كل تطور ، مهدت التكنولوجيا الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا الخلية والكيمياء الحيوية لاستكشاف توطين واستيعاب مستقبلات الغشاء في خطوط الخلايا المختلفة.