طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

الهدف العام من هذه الشاشة هو تحديد مثبطات بروتين كيناز الجزيئات الصغيرة التي تعدل تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات الخلايا الجذعية الجنينية من خلال تحديد مسارات إشارات بروتين كيناز الجديدة التي تنظم تعدد القدرات للخلايا الجذعية الجنينية. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الشاشة سهلة الأداء نسبيا باستخدام معدات المختبرات القياسية والكواشف المتاحة بسهولة.

خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن معظم الأبحاث في مسارات إشارات تعدد القدرات قد تجاهلت تماما موجات هائلة من الحروف. قم بإعداد أطباق مغلفة بالجيلاتين مقاس 10 سم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من 0.1٪ جيلاتين إلى ألواح 10 سم. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، استنشق الجيلاتين واترك الطبق يجف لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، ضع أي خط خلية ES قياسي للفأر على الأطباق المطلية في وسائط خلية ES للفأر القياسية التي تحتوي على 100 نانوغرام لكل مليلتر من LIF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، و 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية ، و 5٪ استبدال مصل بالضربة القاضية. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ CO2 واستبدل الوسائط كل يوم. قم بتمرير خلايا ES للفأر عند حوالي 80٪ من التقاء كل يومين عن طريق شفط الوسائط وغسلها بخمسة ملليلتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لكل طبق.

بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من التربسين EDTA لكل طبق من خلايا ES للفأر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أعد تعليق الخلايا المرتبزة في أربعة ملليلتر من الوسائط وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة تماما في خمسة ملليلتر من الوسائط ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل لتوليد تعليق خلية واحدة.

عد الخلايا عن طريق الجمع بين معلق خلية 10 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من التربان الأزرق. ضع الخليط في غرفة عد الخلايا أو استخدم مقياس كثافة الدم والمجهر الضوئي. بعد ذلك ، قم بزرع 3000 خلية ES من الفأر في 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 96 لوحة بئر في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر من الوسائط باستخدام ماصة متعددة القنوات.

بعد ذلك، ضع مثبطات كيناز عند تخفيف من واحد إلى 100 باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بعمل ماصة الوسائط برفق لخلط المثبط وتعليق الخلية. بعد ذلك ، اسمح للخلايا بالاستقرار في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة لضمان التوزيع المتساوي عبر سطح الطلاء.

استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة دون تغيير الوسائط. لبدء تحليل الفرز ، اغسل 96 لوحة خلية ES من الفأر في 200 ميكرولتر من PBS باستخدام شفاط متعدد القنوات وماصات. بعد الغسيل ، اخلطي مستخلصات الخلايا في 150 ميكرولتر من محلول التحلل.

قم بتوضيح المستخلصات عن طريق الطرد المركزي عند 1500 مرة G لمدة 30 دقيقة في ألواح 96 بئر ذات قاع V. بعد ذلك ، قم بتثبيت 100 ميكرولتر من المواد الطافية على غشاء النيتروسليلوز باستخدام مشعب مخطط نقطة مفرغة 96 جيدا. جفف الغشاء وصمة عار ب 40 مل من Ponceau S لضمان النقل المتسق.

بعد غسل الغشاء باستخدام TBST ، قم بمنعه في TBST بالإضافة إلى 3٪ حليب. بعد ذلك ، احتضان الغشاء في الأجسام المضادة Nanog و Dnmt3b عند تخفيف واحد إلى 1000 في المخزن المؤقت للحجب بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في TBST.

ثم احتضانه في 30 مل من الأجسام المضادة الثانوية عند تخفيف من واحد إلى 10،000 في المخزن المؤقت المانع. تطوير الغشاء باستخدام نظام التصوير المناعي الرقمي. من الأهمية بمكان التحقق من صحة مثبطات كيناز المحددة في الشاشة باستخدام النشاف المناعي التقليدي قبل المتابعة.

يساعد هذا في إزالة الإيجابيات الخاطئة قبل إجراء مزيد من التحليل النهائي. قم بتحليل بيانات الشاشة والتحقق من صحة المثبطات كمنظمات متعددة القدرات حقيقية كما هو موضح في بروتوكول النص. يظهر هنا مخطط Nanog dot تمثيلي من الشاشة التي تم إجراؤها.

يتم تسليط الضوء على مثبطات التحكم الإيجابية التي تدفع تعدد القدرات الجاهزة أو الساذجة. يظهر أيضا مخطط نقطي تمثيلي Dnmt3b من الشاشة التي تم إجراؤها. يتم تسليط الضوء مرة أخرى على مثبطات التحكم الإيجابية التي تدفع تعدد القدرات الجاهزة أو الساذجة.

في هذه المؤامرة ، تم تصنيف المثبطات لنسبة Nanog إلى Dnmt3b. تم تعيين عتبة نسبة Nanog إلى Dnmt3b ذات الشقين لتحديد المثبطات التي تعمل على استقرار تعدد القدرات الساذجة أو الجاهزة. كما يتم توفير إشارات Nanog و Dnmt3b المجمعة.

بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مثبطات كيناز المختارة لمزيد من التحقق من الصحة. يظهر هنا التحقق من صحة اللطخة المناعية التقليدية لمثبطات كيناز المختارة ، والبقع المناعية Nanog و Dnmt3b ، بالإضافة إلى نسبة Nanog إلى Dnmt3b والإشارة الإجمالية التي يتم توفيرها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على مثبطات كيناز الجزيئات الصغيرة التي تعدل تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمسارات إشارات كيناز التي تتحكم في تعدد القدرات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنظمة التنظيمية الأخرى مثل المعدلات اللاجينية بعد الإجراء ، يمكن استخدام مكتبات أخرى من مثبطات الجزيئات الصغيرة ، مثل تلك التي تستهدف المعدلات اللاجينية ، لتحديد لاعبين جدد في تنظيم تعدد القدرات.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لمجموعتنا البحثية لتوضيح مسارات إشارات جديدة متعددة القدرات. نستخدم هذه التقنية لتحديد دور جديد للمسار المضخم في تنظيم تعدد القدرات.