طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية
May 12th, 2017
هنا، نقدم بروتوكول الكمي وقابلة للتنفيذ لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد.
الهدف العام من هذه الشاشة هو تحديد مثبطات بروتين كيناز الجزيئات الصغيرة التي تعدل تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات الخلايا الجذعية الجنينية من خلال تحديد مسارات إشارات بروتين كيناز الجديدة التي تنظم تعدد القدرات للخلايا الجذعية الجنينية. لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الشاشة سهلة الأداء نسبيا باستخدام معدات المختبرات القياسية والكواشف المتاحة بسهولة.
خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا أن معظم الأبحاث في مسارات إشارات تعدد القدرات قد تجاهلت تماما موجات هائلة من الحروف. قم بإعداد أطباق مغلفة بالجيلاتين مقاس 10 سم عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من 0.1٪ جيلاتين إلى ألواح 10 سم. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، استنشق الجيلاتين واترك الطبق يجف لمدة دقيقتين.
بعد ذلك ، ضع أي خط خلية ES قياسي للفأر على الأطباق المطلية في وسائط خلية ES للفأر القياسية التي تحتوي على 100 نانوغرام لكل مليلتر من LIF الموسوم بضريبة السلع والخدمات ، و 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية ، و 5٪ استبدال مصل بالضربة القاضية. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ CO2 واستبدل الوسائط كل يوم. قم بتمرير خلايا ES للفأر عند حوالي 80٪ من التقاء كل يومين عن طريق شفط الوسائط وغسلها بخمسة ملليلتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات لكل طبق.
بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من التربسين EDTA لكل طبق من خلايا ES للفأر واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة ، أعد تعليق الخلايا المرتبزة في أربعة ملليلتر من الوسائط وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 1200 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية الناتجة تماما في خمسة ملليلتر من الوسائط ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل لتوليد تعليق خلية واحدة.
عد الخلايا عن طريق الجمع بين معلق خلية 10 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من التربان الأزرق. ضع الخليط في غرفة عد الخلايا أو استخدم مقياس كثافة الدم والمجهر الضوئي. بعد ذلك ، قم بزرع 3000 خلية ES من الفأر في 0.1٪ مغلفة بالجيلاتين 96 لوحة بئر في حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر من الوسائط باستخدام ماصة متعددة القنوات.
بعد ذلك، ضع مثبطات كيناز عند تخفيف من واحد إلى 100 باستخدام ماصة متعددة القنوات. قم بعمل ماصة الوسائط برفق لخلط المثبط وتعليق الخلية. بعد ذلك ، اسمح للخلايا بالاستقرار في غطاء مزرعة الأنسجة لمدة ساعة واحدة لضمان التوزيع المتساوي عبر سطح الطلاء.
استزراع الخلايا لمدة 48 ساعة دون تغيير الوسائط. لبدء تحليل الفرز ، اغسل 96 لوحة خلية ES من الفأر في 200 ميكرولتر من PBS باستخدام شفاط متعدد القنوات وماصات. بعد الغسيل ، اخلطي مستخلصات الخلايا في 150 ميكرولتر من محلول التحلل.
قم بتوضيح المستخلصات عن طريق الطرد المركزي عند 1500 مرة G لمدة 30 دقيقة في ألواح 96 بئر ذات قاع V. بعد ذلك ، قم بتثبيت 100 ميكرولتر من المواد الطافية على غشاء النيتروسليلوز باستخدام مشعب مخطط نقطة مفرغة 96 جيدا. جفف الغشاء وصمة عار ب 40 مل من Ponceau S لضمان النقل المتسق.
بعد غسل الغشاء باستخدام TBST ، قم بمنعه في TBST بالإضافة إلى 3٪ حليب. بعد ذلك ، احتضان الغشاء في الأجسام المضادة Nanog و Dnmt3b عند تخفيف واحد إلى 1000 في المخزن المؤقت للحجب بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، اغسل الغشاء ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في TBST.
ثم احتضانه في 30 مل من الأجسام المضادة الثانوية عند تخفيف من واحد إلى 10،000 في المخزن المؤقت المانع. تطوير الغشاء باستخدام نظام التصوير المناعي الرقمي. من الأهمية بمكان التحقق من صحة مثبطات كيناز المحددة في الشاشة باستخدام النشاف المناعي التقليدي قبل المتابعة.
يساعد هذا في إزالة الإيجابيات الخاطئة قبل إجراء مزيد من التحليل النهائي. قم بتحليل بيانات الشاشة والتحقق من صحة المثبطات كمنظمات متعددة القدرات حقيقية كما هو موضح في بروتوكول النص. يظهر هنا مخطط Nanog dot تمثيلي من الشاشة التي تم إجراؤها.
يتم تسليط الضوء على مثبطات التحكم الإيجابية التي تدفع تعدد القدرات الجاهزة أو الساذجة. يظهر أيضا مخطط نقطي تمثيلي Dnmt3b من الشاشة التي تم إجراؤها. يتم تسليط الضوء مرة أخرى على مثبطات التحكم الإيجابية التي تدفع تعدد القدرات الجاهزة أو الساذجة.
في هذه المؤامرة ، تم تصنيف المثبطات لنسبة Nanog إلى Dnmt3b. تم تعيين عتبة نسبة Nanog إلى Dnmt3b ذات الشقين لتحديد المثبطات التي تعمل على استقرار تعدد القدرات الساذجة أو الجاهزة. كما يتم توفير إشارات Nanog و Dnmt3b المجمعة.
بالإضافة إلى ذلك ، لوحظت مثبطات كيناز المختارة لمزيد من التحقق من الصحة. يظهر هنا التحقق من صحة اللطخة المناعية التقليدية لمثبطات كيناز المختارة ، والبقع المناعية Nanog و Dnmt3b ، بالإضافة إلى نسبة Nanog إلى Dnmt3b والإشارة الإجمالية التي يتم توفيرها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التعرف على مثبطات كيناز الجزيئات الصغيرة التي تعدل تعدد القدرات في الخلايا الجذعية الجنينية.
بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون 72 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمسارات إشارات كيناز التي تتحكم في تعدد القدرات ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على تمايز الخلايا الجذعية الجنينية والأنظمة التنظيمية الأخرى مثل المعدلات اللاجينية بعد الإجراء ، يمكن استخدام مكتبات أخرى من مثبطات الجزيئات الصغيرة ، مثل تلك التي تستهدف المعدلات اللاجينية ، لتحديد لاعبين جدد في تنظيم تعدد القدرات.
بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لمجموعتنا البحثية لتوضيح مسارات إشارات جديدة متعددة القدرات. نستخدم هذه التقنية لتحديد دور جديد للمسار المضخم في تنظيم تعدد القدرات.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا كميًا وقابلاً للتطوير لشاشات الجزيئات الصغيرة المستهدفة التي تهدف إلى تحديد منظمي الكيناز لانتقال الخلايا الجذعية البدائية إلى متعددة القدرات. تم تصميم هذه الطريقة لتعزيز فهم مسارات إشارات الخلايا الجذعية الجنينية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- بيولوجيا الخلية
- بحوث الخلايا الجذعية
- نقل الإشارة
الخلفية
- تنظم مسارات إشارات متعددة القدرات للخلايا الجذعية الجنينية من خلال مسارات إشارات مختلفة.
- الأبحاث السابقة قد أغفلت العديد من مكونات الكينوم.
- تحديد مثبطات الكيناز الجديدة يمكن أن يوفر رؤى حول تنظيم متعددة القدرات.
- تهدف هذه الدراسة إلى ملء الفجوات في المعرفة الحالية بشأن إشارات الكيناز في الخلايا الجذعية.
غرض الدراسة
- تحديد مثبطات كيناز البروتين للجزيئات الصغيرة التي تعدل متعددة القدرات للخلايا الجذعية الجنينية.
- توضيح مسارات إشارات كيناز البروتين الجديدة المتورطة في متعددة القدرات.
- تطوير طريقة فحص مباشرة باستخدام معدات المختبرات القياسية.
الطرق المستخدمة
- تحضير الأطباق المطلية بالجيلاتين لزراعة الخلايا.
- زرع الخلايا الجذعية الجنينية للفئران وتطبيق مثبطات الكيناز.
- تحليل الفحص من خلال تقنيات المناعة الغشائية.
- التحقق من صحة مثبطات الكيناز المحددة باستخدام الطرق التقليدية.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لمثبطات الكيناز التي تستقر متعددة القدرات البدائية أو الموجهة.
- كشفت تحليل البيانات عن حدين لنسبة Nanog إلى Dnmt3b لاختيار المثبط.
- تأكيد التحقق من صحة المثبطات المختارة لدورها في تنظيم متعددة القدرات.
- الرؤى المكتسبة يمكن تطبيقها على أنظمة تنظيمية أخرى وعمليات التمايز.
الاستنتاجات
- يسمح البروتوكول المطور بالفحص الفعال لمثبطات الكيناز.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لدراسة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية استكشاف المعدلات اللاجينية في تنظيم متعددة القدرات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
