نظرة عامة على الهندسة الوراثية
الهندسة الوراثية هي التغيير الهادف للحمض النووي للكائن الحي. سمح التقدم في هذا المجال للعلماء بتوليد خلايا وكائنات معدلة وراثيا للبحوث الطبية الحيوية والأغراض الزراعية. ومع ذلك ، فإن تطبيق التقنيات الجينية لاستخدامها كعلاجات في البشر ، والمعروف باسم العلاج الجيني ، لا يزال قيد التقدم.
في هذا الفيديو ، سنناقش بعض الاكتشافات المهمة في تاريخ الهندسة الوراثية ، والأسئلة الرئيسية التي تتم دراستها اليوم ، والأدوات المهمة لتغيير جينوم الكائن الحي ، والعديد من تطبيقات هذه التقنيات.
لنبدأ بمراجعة تاريخ الهندسة الوراثية.
تتوقف قدرة العلماء على التلاعب المباشر بالجينات على حل هوية المادة الجينية. في عام 1928 ، لاحظ فريدريك جريفيث أن حقن مزيج من البكتيريا الخبيثة المقتولة بالحرارة وسلالة حية ، ولكن غير ضارة ، في الفئران أدت إلى المرض ، مما دفعه إلى افتراض "مبدأ تحويل" ينتقل من البكتيريا الميتة إلى البكتيريا الحية.
في عام 1944 ، حدد أوزوالد أفيري وكولين ماكلويد وماكلين مكارتي الحمض النووي للبكتيريا على أنه مسؤول عن هذا التحول. تم التحقق من صحة النتيجة بشكل أكبر في عام 1952 ، عندما استخدم ألفريد هيرشي ومارثا تشيس العاثية ذات العلامات المشعة لإظهار أن الحمض النووي للفيروس ، وليس البروتين ، هو الذي انتقل أثناء إصابته بالخلايا البكتيرية.
في عام 1952 أيضا ، افترض جوشوا ليدربيرج وجود البلازميدات - قطع دائرية صغيرة من الحمض النووي يمكن أن تنتقل بين البكتيريا. في نفس الوقت تقريبا ، وصف أيضا التنبيغ ، حيث تعمل الفيروسات كنواقل لنقل الحمض النووي بين الخلايا.
ابتداء من حوالي عام 1970 ، بدأ باحثون مثل هاميلتون سميث في اكتشاف بعض "الأدوات" العملية للهندسة الوراثية ، مثل نوكليازات التقييد ، التي "تقطع" الحمض النووي في تسلسلات محددة. باستخدام هذه الأدوات ، في عام 1972 ، أنتج بول بيرج أول جزيء DNA "مؤتلف" من خلال ربط الحمض النووي من فيروسين مختلفين ، وفي موازاة ذلك ، أنتج ستانلي كوهين وهربرت بوير أول كائن حي مؤتلف عن طريق وضع جين مقاوم للمضادات الحيوية على البلازميد وتحويل هذا البناء إلى بكتيريا الإشريكية القولونية .
في عام 1973 ، ابتكر رودولف جاينيش أول كائن متعدد الخلايا معدلة وراثيا ، وهو فأر يحتوي على الحمض النووي الفيروسي SV40 ، على الرغم من أنه لم يكن حتى عام 1981 عندما أنشأت العديد من المختبرات الأخرى أول فئران معدلة وراثيا قادرة على تمرير الجينات التي تم إدخالها إلى نسلها. في منتصف الثمانينيات ، أثبت ماريو كابيتشي وأوليفر سميثيز لأول مرة أنه يمكن استخدام إعادة التركيب المتماثل لاستهداف الجينات على وجه التحديد ، وفي عام 1989 استخدموا هذه الطريقة لتوليد أول فأر بالضربة القاضية ، حيث يصبح الجين غير وظيفي.
بعد ذلك ، دعنا نفحص بعض الأسئلة الرئيسية في الهندسة الوراثية.
يتمثل أحد المجالات الأساسية للبحث في تحديد أفضل طريقة لتعديل جينوم الكائن الحي. يجب مراعاة عدد من العوامل ، بما في ذلك كفاءة عملية التعديل ، وكذلك ما إذا كان التعديل يحتاج إلى استهداف جينات معينة لتقليل مخاطر التغيرات غير المقصودة في الحمض النووي الخلوي.
من أجل تعديل جينوم الخلية المضيفة ، يجب تسليم تسلسل الحمض النووي المجمع بشكل مصطنع لإجراء هذا التعديل ، والمعروف باسم "البناء الجيني" ، بنجاح إلى تلك الخلية. يهدف البحث في هذا المجال إلى زيادة الكفاءة مع الحد من السمية الخلوية. على مستوى الكائنات الحية ، يدرس الباحثون كيفية تعديل النواقل مثل جزيئات الفيروسات القهقرية أو الجسيمات النانوية لتحسين توصيل البناء إلى مجموعات الخلايا المستهدفة.
أخيرا ، هناك الكثير من الاهتمام بما إذا كان يمكن تطبيق الهندسة الوراثية بنجاح على الاستخدامات الزراعية أو العلاجية. تم استخدام هذه التقنيات لتوليد أدوات بحث قوية مثل الفئران التي تم حذف الجينات فيها أو "طردها" ، أو لإدخال سمات بسيطة ومفردة مثل مقاومة مبيدات الأعشاب في المحاصيل. ومع ذلك ، من المحتمل أن تتطلب المشكلات المعقدة ، مثل توليد المحاصيل التي تزدهر في ظروف معاكسة ، تعديل مسارات متعددة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، فإن تطوير العلاجات الجينية لعلاج الأمراض الوراثية ، مما يستلزم إيصال التركيبات الجينية إلى الخلايا البشرية بشكل آمن وفعال ، لا يزال مهمة صعبة.
دعونا الآن نلقي نظرة على أدوات وتقنيات الهندسة الوراثية التي يستخدمها الباحثون.
الطريقة الكلاسيكية لتوليد التركيبات الجينية هي الاستنساخ القائم على الإنزيم التقييدي ، حيث يتم هضم قطع الحمض النووي ثم إعادة تجميعها بترتيب معين باستخدام ليغازات الحمض النووي لإنشاء بلازميد جديد. تشمل التقنيات الأحدث إعادة التركيب ، والتي تستخدم إعادة التركيب المتماثل لعزل وتبادل شظايا الحمض النووي دون الحاجة إلى مواقع هضم إنزيم التقييد.
يمكن توصيل الحمض النووي إلى الخلايا بعدد من الطرق. التحول أو التعداء هو عملية تحويل الحمض النووي العاري إلى خلايا بكتيرية أو حقيقية النواة ، على التوالي. يمكن للكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مثل الكالسيوم ، أن تجعل أغشية الخلايا أكثر مسامية ، مما يزيد من امتصاص جزيئات الحمض النووي الخارجية. يستخدم التثقيب الكهربائي مجالا كهربائيا لإنجاز نفس المهمة ، بينما يمكن للجسيمات النانوية الدهنية التي تحيط بالحمض النووي أن تندمج مع غشاء الخلية وتطلق حمولته. يشير التنبيغ إلى نقل الحمض النووي بواسطة ناقل فيروسي ، مثل فيروس العدس.
يتطلب توصيل التركيبات الجينية إلى كائنات متعددة الخلايا اعتبارات إضافية. عند وجود أنواع متعددة من الخلايا ، تزيد النواقل المستهدفة مثل الفيروسات أو الجسيمات النانوية من خصوصية توصيل الخلية. في النباتات ، اختار الباحثون البكتيريا الزراعية ، وهي مسببات الأمراض النباتية القادرة على نقل الحمض النووي إلى الخلايا النباتية ، كأداة لتوصيل الجينات. تشير كلمة "Biolistics" إلى استخدام "مسدس الجينات" لتوصيل حبات ذهبية مطلية بالحمض النووي إلى الخلايا.
أخيرا ، تحتاج تركيبات الحمض النووي التي تم تسليمها إلى إجراء تغييرات دائمة على جينوم المضيف من أجل تحقيق تأثيرات طويلة المدى. يمكن أن يحدث هذا عن طريق التكامل العشوائي لبنية الحمض النووي التي تم تسليمها في الحمض النووي المضيف ، والتي يمكن تعزيزها عن طريق وضع علامات على البناء بمواقع التعرف على إنزيمات "القطع واللصق" للحمض النووي التي تسمى الينقولازات. من ناحية أخرى ، تسمح تقنيات مثل استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل بالاندماج في مواقع جينومية محددة. التطورات الحديثة في التقنيات المعروفة باسم تحرير الجينوم ، والتي تستخدم نوكليازات مصممة خصيصا لتوليد فواصل مزدوجة الخيط في مواقع محددة ، تحسن بشكل كبير من كفاءة استهداف الجينات.
الآن ، دعونا نلقي نظرة على كيفية تطبيق تقنيات الهندسة الوراثية اليوم.
يتم تقسيم الوظائف الخلوية في حقيقيات النوى إلى عضيات ، وقد يسمح استهداف تعبير البروتين المعدل وراثيا إلى المقصورات الفردية بتأثيرات بيولوجية أكثر تحديدا. في هذه التجربة ، أنشأ الباحثون بنية مراسل تحمل علامة GFP باستخدام تقنية تجميع جيبسون ، حيث تسمح مناطق التداخل المتماثلة بين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعددة بتوليد بنية كاملة دون استخدام إنزيمات التقييد. تم استخدام التعدي البيولوجي لتوصيل هذه التركيبات إلى الخلايا النباتية ، وتمكن الباحثون من إثبات تعبير GFP الذي يستهدف البلاستيدات الخضراء.
غالبا ما تفرط الخلايا السرطانية في التعبير عن المستقبلات السطحية ، والتي يمكن للباحثين استهدافها باستخدام العلاج الجيني. هنا ، أنشأ العلماء نموذجا لسرطان المثانة البشري في الفأر. يتبع ذلك توصيل موضعي لناقل الفيروس الغدي إلى خلايا سرطان المثانة. أشارت ملاحظة تعبير لوسيفيراز في الخلايا السرطانية إلى التسليم الناجح لجين المراسل.
أخيرا ، يتم إحراز تقدم في هندسة المسارات البيولوجية الكاملة في الكائن الحي المستهدف. هنا ، تم عزل كل جين من مسار التخليق الحيوي للمضاد الحيوي الإريثروميسين من البكتيريا المضيفة ، Saccharopolyspora erythraea ، عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ودمجها في تركيبات شبيهة بالمشغل حيث يتم وضع سلسلة من الجينات تحت السيطرة بواسطة نفس العناصر التنظيمية للسماح بالتعبير الأمثل. ثم تم تحويل هذه التركيبات إلى الإشريكية القولونية لإعادة تشكيل مسار التوليف ، ويمكن بعد ذلك تنقية المنتج المنتج غير المتجانس واختباره من أجل الوظيفة.
لقد شاهدت للتو نظرة عامة على JoVE عن الهندسة الوراثية. في هذا الفيديو ، ناقشنا تاريخ الهندسة الوراثية ، وفحصنا الأسئلة الرئيسية والأدوات في هذا المجال ، وقدمنا عدة أمثلة لتطبيقات الهندسة الوراثية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تم استخدام الهندسة الوراثية - عملية تغيير الحمض النووي للكائن الحي عن قصد - لإنشاء أدوات بحث قوية ونماذج للكائنات الحية ، وشهدت أيضا العديد من التطبيق…
الهندسة الوراثية هي التغيير الهادف للحمض النووي للكائن الحي. سمح التقدم في هذا المجال للعلماء بتوليد خلايا وكائنات معدلة وراثيا للبحوث الطبية الحيوية والأغراض الزراعية. ومع ذلك ، فإن تطبيق التقنيات الجينية لاستخدامها كعلاجات في البشر ، والمعروف باسم العلاج الجيني ، لا يزال قيد التقدم.
في هذا الفيديو ، سنناقش بعض الاكتشافات المهمة في تاريخ الهندسة الوراثية ، والأسئلة الرئيسية التي تتم دراستها اليوم ، والأدوات المهمة لتغيير جينوم الكائن الحي ، والعديد من تطبيقات هذه التقنيات.
لنبدأ بمراجعة تاريخ الهندسة الوراثية.
تتوقف قدرة العلماء على التلاعب المباشر بالجينات على حل هوية المادة الجينية. في عام 1928 ، لاحظ فريدريك جريفيث أن حقن مزيج من البكتيريا الخبيثة المقتولة بالحرارة وسلالة حية ، ولكن غير ضارة ، في الفئران أدت إلى المرض ، مما دفعه إلى افتراض "مبدأ تحويل" ينتقل من البكتيريا الميتة إلى البكتيريا الحية.
في عام 1944 ، حدد أوزوالد أفيري وكولين ماكلويد وماكلين مكارتي الحمض النووي للبكتيريا على أنه مسؤول عن هذا التحول. تم التحقق من صحة النتيجة بشكل أكبر في عام 1952 ، عندما استخدم ألفريد هيرشي ومارثا تشيس العاثية ذات العلامات المشعة لإظهار أن الحمض النووي للفيروس ، وليس البروتين ، هو الذي انتقل أثناء إصابته بالخلايا البكتيرية.
في عام 1952 أيضا ، افترض جوشوا ليدربيرج وجود البلازميدات - قطع دائرية صغيرة من الحمض النووي يمكن أن تنتقل بين البكتيريا. في نفس الوقت تقريبا ، وصف أيضا التنبيغ ، حيث تعمل الفيروسات كنواقل لنقل الحمض النووي بين الخلايا.
ابتداء من حوالي عام 1970 ، بدأ باحثون مثل هاميلتون سميث في اكتشاف بعض "الأدوات" العملية للهندسة الوراثية ، مثل نوكليازات التقييد ، التي "تقطع" الحمض النووي في تسلسلات محددة. باستخدام هذه الأدوات ، في عام 1972 ، أنتج بول بيرج أول جزيء DNA "مؤتلف" من خلال ربط الحمض النووي من فيروسين مختلفين ، وفي موازاة ذلك ، أنتج ستانلي كوهين وهربرت بوير أول كائن حي مؤتلف عن طريق وضع جين مقاوم للمضادات الحيوية على البلازميد وتحويل هذا البناء إلى بكتيريا الإشريكية القولونية .
في عام 1973 ، ابتكر رودولف جاينيش أول كائن متعدد الخلايا معدلة وراثيا ، وهو فأر يحتوي على الحمض النووي الفيروسي SV40 ، على الرغم من أنه لم يكن حتى عام 1981 عندما أنشأت العديد من المختبرات الأخرى أول فئران معدلة وراثيا قادرة على تمرير الجينات التي تم إدخالها إلى نسلها. في منتصف الثمانينيات ، أثبت ماريو كابيتشي وأوليفر سميثيز لأول مرة أنه يمكن استخدام إعادة التركيب المتماثل لاستهداف الجينات على وجه التحديد ، وفي عام 1989 استخدموا هذه الطريقة لتوليد أول فأر بالضربة القاضية ، حيث يصبح الجين غير وظيفي.
بعد ذلك ، دعنا نفحص بعض الأسئلة الرئيسية في الهندسة الوراثية.
يتمثل أحد المجالات الأساسية للبحث في تحديد أفضل طريقة لتعديل جينوم الكائن الحي. يجب مراعاة عدد من العوامل ، بما في ذلك كفاءة عملية التعديل ، وكذلك ما إذا كان التعديل يحتاج إلى استهداف جينات معينة لتقليل مخاطر التغيرات غير المقصودة في الحمض النووي الخلوي.
من أجل تعديل جينوم الخلية المضيفة ، يجب تسليم تسلسل الحمض النووي المجمع بشكل مصطنع لإجراء هذا التعديل ، والمعروف باسم "البناء الجيني" ، بنجاح إلى تلك الخلية. يهدف البحث في هذا المجال إلى زيادة الكفاءة مع الحد من السمية الخلوية. على مستوى الكائنات الحية ، يدرس الباحثون كيفية تعديل النواقل مثل جزيئات الفيروسات القهقرية أو الجسيمات النانوية لتحسين توصيل البناء إلى مجموعات الخلايا المستهدفة.
أخيرا ، هناك الكثير من الاهتمام بما إذا كان يمكن تطبيق الهندسة الوراثية بنجاح على الاستخدامات الزراعية أو العلاجية. تم استخدام هذه التقنيات لتوليد أدوات بحث قوية مثل الفئران التي تم حذف الجينات فيها أو "طردها" ، أو لإدخال سمات بسيطة ومفردة مثل مقاومة مبيدات الأعشاب في المحاصيل. ومع ذلك ، من المحتمل أن تتطلب المشكلات المعقدة ، مثل توليد المحاصيل التي تزدهر في ظروف معاكسة ، تعديل مسارات متعددة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، فإن تطوير العلاجات الجينية لعلاج الأمراض الوراثية ، مما يستلزم إيصال التركيبات الجينية إلى الخلايا البشرية بشكل آمن وفعال ، لا يزال مهمة صعبة.
دعونا الآن نلقي نظرة على أدوات وتقنيات الهندسة الوراثية التي يستخدمها الباحثون.
الطريقة الكلاسيكية لتوليد التركيبات الجينية هي الاستنساخ القائم على الإنزيم التقييدي ، حيث يتم هضم قطع الحمض النووي ثم إعادة تجميعها بترتيب معين باستخدام ليغازات الحمض النووي لإنشاء بلازميد جديد. تشمل التقنيات الأحدث إعادة التركيب ، والتي تستخدم إعادة التركيب المتماثل لعزل وتبادل شظايا الحمض النووي دون الحاجة إلى مواقع هضم إنزيم التقييد.
يمكن توصيل الحمض النووي إلى الخلايا بعدد من الطرق. التحول أو التعداء هو عملية تحويل الحمض النووي العاري إلى خلايا بكتيرية أو حقيقية النواة ، على التوالي. يمكن للكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مثل الكالسيوم ، أن تجعل أغشية الخلايا أكثر مسامية ، مما يزيد من امتصاص جزيئات الحمض النووي الخارجية. يستخدم التثقيب الكهربائي مجالا كهربائيا لإنجاز نفس المهمة ، بينما يمكن للجسيمات النانوية الدهنية التي تحيط بالحمض النووي أن تندمج مع غشاء الخلية وتطلق حمولته. يشير التنبيغ إلى نقل الحمض النووي بواسطة ناقل فيروسي ، مثل فيروس العدس.
يتطلب توصيل التركيبات الجينية إلى كائنات متعددة الخلايا اعتبارات إضافية. عند وجود أنواع متعددة من الخلايا ، تزيد النواقل المستهدفة مثل الفيروسات أو الجسيمات النانوية من خصوصية توصيل الخلية. في النباتات ، اختار الباحثون البكتيريا الزراعية ، وهي مسببات الأمراض النباتية القادرة على نقل الحمض النووي إلى الخلايا النباتية ، كأداة لتوصيل الجينات. تشير كلمة "Biolistics" إلى استخدام "مسدس الجينات" لتوصيل حبات ذهبية مطلية بالحمض النووي إلى الخلايا.
أخيرا ، تحتاج تركيبات الحمض النووي التي تم تسليمها إلى إجراء تغييرات دائمة على جينوم المضيف من أجل تحقيق تأثيرات طويلة المدى. يمكن أن يحدث هذا عن طريق التكامل العشوائي لبنية الحمض النووي التي تم تسليمها في الحمض النووي المضيف ، والتي يمكن تعزيزها عن طريق وضع علامات على البناء بمواقع التعرف على إنزيمات "القطع واللصق" للحمض النووي التي تسمى الينقولازات. من ناحية أخرى ، تسمح تقنيات مثل استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل بالاندماج في مواقع جينومية محددة. التطورات الحديثة في التقنيات المعروفة باسم تحرير الجينوم ، والتي تستخدم نوكليازات مصممة خصيصا لتوليد فواصل مزدوجة الخيط في مواقع محددة ، تحسن بشكل كبير من كفاءة استهداف الجينات.
الآن ، دعونا نلقي نظرة على كيفية تطبيق تقنيات الهندسة الوراثية اليوم.
يتم تقسيم الوظائف الخلوية في حقيقيات النوى إلى عضيات ، وقد يسمح استهداف تعبير البروتين المعدل وراثيا إلى المقصورات الفردية بتأثيرات بيولوجية أكثر تحديدا. في هذه التجربة ، أنشأ الباحثون بنية مراسل تحمل علامة GFP باستخدام تقنية تجميع جيبسون ، حيث تسمح مناطق التداخل المتماثلة بين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعددة بتوليد بنية كاملة دون استخدام إنزيمات التقييد. تم استخدام التعدي البيولوجي لتوصيل هذه التركيبات إلى الخلايا النباتية ، وتمكن الباحثون من إثبات تعبير GFP الذي يستهدف البلاستيدات الخضراء.
غالبا ما تفرط الخلايا السرطانية في التعبير عن المستقبلات السطحية ، والتي يمكن للباحثين استهدافها باستخدام العلاج الجيني. هنا ، أنشأ العلماء نموذجا لسرطان المثانة البشري في الفأر. يتبع ذلك توصيل موضعي لناقل الفيروس الغدي إلى خلايا سرطان المثانة. أشارت ملاحظة تعبير لوسيفيراز في الخلايا السرطانية إلى التسليم الناجح لجين المراسل.
أخيرا ، يتم إحراز تقدم في هندسة المسارات البيولوجية الكاملة في الكائن الحي المستهدف. هنا ، تم عزل كل جين من مسار التخليق الحيوي للمضاد الحيوي الإريثروميسين من البكتيريا المضيفة ، Saccharopolyspora erythraea ، عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ودمجها في تركيبات شبيهة بالمشغل حيث يتم وضع سلسلة من الجينات تحت السيطرة بواسطة نفس العناصر التنظيمية للسماح بالتعبير الأمثل. ثم تم تحويل هذه التركيبات إلى الإشريكية القولونية لإعادة تشكيل مسار التوليف ، ويمكن بعد ذلك تنقية المنتج المنتج غير المتجانس واختباره من أجل الوظيفة.
لقد شاهدت للتو نظرة عامة على JoVE عن الهندسة الوراثية. في هذا الفيديو ، ناقشنا تاريخ الهندسة الوراثية ، وفحصنا الأسئلة الرئيسية والأدوات في هذا المجال ، وقدمنا عدة أمثلة لتطبيقات الهندسة الوراثية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
الهندسة الوراثية هي التغيير الهادف للحمض النووي للكائن الحي. سمح التقدم في هذا المجال للعلماء بتوليد خلايا وكائنات معدلة وراثيا للبحوث الطبية الحيوية والأغراض الزراعية. ومع ذلك ، فإن تطبيق التقنيات الجينية لاستخدامها كعلاجات في البشر ، والمعروف باسم العلاج الجيني ، لا يزال قيد التقدم.
في هذا الفيديو ، سنناقش بعض الاكتشافات المهمة في تاريخ الهندسة الوراثية ، والأسئلة الرئيسية التي تتم دراستها اليوم ، والأدوات المهمة لتغيير جينوم الكائن الحي ، والعديد من تطبيقات هذه التقنيات.
لنبدأ بمراجعة تاريخ الهندسة الوراثية.
تتوقف قدرة العلماء على التلاعب المباشر بالجينات على حل هوية المادة الجينية. في عام 1928 ، لاحظ فريدريك جريفيث أن حقن مزيج من البكتيريا الخبيثة المقتولة بالحرارة وسلالة حية ، ولكن غير ضارة ، في الفئران أدت إلى المرض ، مما دفعه إلى افتراض "مبدأ تحويل" ينتقل من البكتيريا الميتة إلى البكتيريا الحية.
في عام 1944 ، حدد أوزوالد أفيري وكولين ماكلويد وماكلين مكارتي الحمض النووي للبكتيريا على أنه مسؤول عن هذا التحول. تم التحقق من صحة النتيجة بشكل أكبر في عام 1952 ، عندما استخدم ألفريد هيرشي ومارثا تشيس العاثية ذات العلامات المشعة لإظهار أن الحمض النووي للفيروس ، وليس البروتين ، هو الذي انتقل أثناء إصابته بالخلايا البكتيرية.
في عام 1952 أيضا ، افترض جوشوا ليدربيرج وجود البلازميدات - قطع دائرية صغيرة من الحمض النووي يمكن أن تنتقل بين البكتيريا. في نفس الوقت تقريبا ، وصف أيضا التنبيغ ، حيث تعمل الفيروسات كنواقل لنقل الحمض النووي بين الخلايا.
ابتداء من حوالي عام 1970 ، بدأ باحثون مثل هاميلتون سميث في اكتشاف بعض "الأدوات" العملية للهندسة الوراثية ، مثل نوكليازات التقييد ، التي "تقطع" الحمض النووي في تسلسلات محددة. باستخدام هذه الأدوات ، في عام 1972 ، أنتج بول بيرج أول جزيء DNA "مؤتلف" من خلال ربط الحمض النووي من فيروسين مختلفين ، وفي موازاة ذلك ، أنتج ستانلي كوهين وهربرت بوير أول كائن حي مؤتلف عن طريق وضع جين مقاوم للمضادات الحيوية على البلازميد وتحويل هذا البناء إلى بكتيريا الإشريكية القولونية .
في عام 1973 ، ابتكر رودولف جاينيش أول كائن متعدد الخلايا معدلة وراثيا ، وهو فأر يحتوي على الحمض النووي الفيروسي SV40 ، على الرغم من أنه لم يكن حتى عام 1981 عندما أنشأت العديد من المختبرات الأخرى أول فئران معدلة وراثيا قادرة على تمرير الجينات التي تم إدخالها إلى نسلها. في منتصف الثمانينيات ، أثبت ماريو كابيتشي وأوليفر سميثيز لأول مرة أنه يمكن استخدام إعادة التركيب المتماثل لاستهداف الجينات على وجه التحديد ، وفي عام 1989 استخدموا هذه الطريقة لتوليد أول فأر بالضربة القاضية ، حيث يصبح الجين غير وظيفي.
بعد ذلك ، دعنا نفحص بعض الأسئلة الرئيسية في الهندسة الوراثية.
يتمثل أحد المجالات الأساسية للبحث في تحديد أفضل طريقة لتعديل جينوم الكائن الحي. يجب مراعاة عدد من العوامل ، بما في ذلك كفاءة عملية التعديل ، وكذلك ما إذا كان التعديل يحتاج إلى استهداف جينات معينة لتقليل مخاطر التغيرات غير المقصودة في الحمض النووي الخلوي.
من أجل تعديل جينوم الخلية المضيفة ، يجب تسليم تسلسل الحمض النووي المجمع بشكل مصطنع لإجراء هذا التعديل ، والمعروف باسم "البناء الجيني" ، بنجاح إلى تلك الخلية. يهدف البحث في هذا المجال إلى زيادة الكفاءة مع الحد من السمية الخلوية. على مستوى الكائنات الحية ، يدرس الباحثون كيفية تعديل النواقل مثل جزيئات الفيروسات القهقرية أو الجسيمات النانوية لتحسين توصيل البناء إلى مجموعات الخلايا المستهدفة.
أخيرا ، هناك الكثير من الاهتمام بما إذا كان يمكن تطبيق الهندسة الوراثية بنجاح على الاستخدامات الزراعية أو العلاجية. تم استخدام هذه التقنيات لتوليد أدوات بحث قوية مثل الفئران التي تم حذف الجينات فيها أو "طردها" ، أو لإدخال سمات بسيطة ومفردة مثل مقاومة مبيدات الأعشاب في المحاصيل. ومع ذلك ، من المحتمل أن تتطلب المشكلات المعقدة ، مثل توليد المحاصيل التي تزدهر في ظروف معاكسة ، تعديل مسارات متعددة في وقت واحد. علاوة على ذلك ، فإن تطوير العلاجات الجينية لعلاج الأمراض الوراثية ، مما يستلزم إيصال التركيبات الجينية إلى الخلايا البشرية بشكل آمن وفعال ، لا يزال مهمة صعبة.
دعونا الآن نلقي نظرة على أدوات وتقنيات الهندسة الوراثية التي يستخدمها الباحثون.
الطريقة الكلاسيكية لتوليد التركيبات الجينية هي الاستنساخ القائم على الإنزيم التقييدي ، حيث يتم هضم قطع الحمض النووي ثم إعادة تجميعها بترتيب معين باستخدام ليغازات الحمض النووي لإنشاء بلازميد جديد. تشمل التقنيات الأحدث إعادة التركيب ، والتي تستخدم إعادة التركيب المتماثل لعزل وتبادل شظايا الحمض النووي دون الحاجة إلى مواقع هضم إنزيم التقييد.
يمكن توصيل الحمض النووي إلى الخلايا بعدد من الطرق. التحول أو التعداء هو عملية تحويل الحمض النووي العاري إلى خلايا بكتيرية أو حقيقية النواة ، على التوالي. يمكن للكاتيونات ثنائية التكافؤ ، مثل الكالسيوم ، أن تجعل أغشية الخلايا أكثر مسامية ، مما يزيد من امتصاص جزيئات الحمض النووي الخارجية. يستخدم التثقيب الكهربائي مجالا كهربائيا لإنجاز نفس المهمة ، بينما يمكن للجسيمات النانوية الدهنية التي تحيط بالحمض النووي أن تندمج مع غشاء الخلية وتطلق حمولته. يشير التنبيغ إلى نقل الحمض النووي بواسطة ناقل فيروسي ، مثل فيروس العدس.
يتطلب توصيل التركيبات الجينية إلى كائنات متعددة الخلايا اعتبارات إضافية. عند وجود أنواع متعددة من الخلايا ، تزيد النواقل المستهدفة مثل الفيروسات أو الجسيمات النانوية من خصوصية توصيل الخلية. في النباتات ، اختار الباحثون البكتيريا الزراعية ، وهي مسببات الأمراض النباتية القادرة على نقل الحمض النووي إلى الخلايا النباتية ، كأداة لتوصيل الجينات. تشير كلمة "Biolistics" إلى استخدام "مسدس الجينات" لتوصيل حبات ذهبية مطلية بالحمض النووي إلى الخلايا.
أخيرا ، تحتاج تركيبات الحمض النووي التي تم تسليمها إلى إجراء تغييرات دائمة على جينوم المضيف من أجل تحقيق تأثيرات طويلة المدى. يمكن أن يحدث هذا عن طريق التكامل العشوائي لبنية الحمض النووي التي تم تسليمها في الحمض النووي المضيف ، والتي يمكن تعزيزها عن طريق وضع علامات على البناء بمواقع التعرف على إنزيمات "القطع واللصق" للحمض النووي التي تسمى الينقولازات. من ناحية أخرى ، تسمح تقنيات مثل استهداف الجينات عن طريق إعادة التركيب المتماثل بالاندماج في مواقع جينومية محددة. التطورات الحديثة في التقنيات المعروفة باسم تحرير الجينوم ، والتي تستخدم نوكليازات مصممة خصيصا لتوليد فواصل مزدوجة الخيط في مواقع محددة ، تحسن بشكل كبير من كفاءة استهداف الجينات.
الآن ، دعونا نلقي نظرة على كيفية تطبيق تقنيات الهندسة الوراثية اليوم.
يتم تقسيم الوظائف الخلوية في حقيقيات النوى إلى عضيات ، وقد يسمح استهداف تعبير البروتين المعدل وراثيا إلى المقصورات الفردية بتأثيرات بيولوجية أكثر تحديدا. في هذه التجربة ، أنشأ الباحثون بنية مراسل تحمل علامة GFP باستخدام تقنية تجميع جيبسون ، حيث تسمح مناطق التداخل المتماثلة بين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المتعددة بتوليد بنية كاملة دون استخدام إنزيمات التقييد. تم استخدام التعدي البيولوجي لتوصيل هذه التركيبات إلى الخلايا النباتية ، وتمكن الباحثون من إثبات تعبير GFP الذي يستهدف البلاستيدات الخضراء.
غالبا ما تفرط الخلايا السرطانية في التعبير عن المستقبلات السطحية ، والتي يمكن للباحثين استهدافها باستخدام العلاج الجيني. هنا ، أنشأ العلماء نموذجا لسرطان المثانة البشري في الفأر. يتبع ذلك توصيل موضعي لناقل الفيروس الغدي إلى خلايا سرطان المثانة. أشارت ملاحظة تعبير لوسيفيراز في الخلايا السرطانية إلى التسليم الناجح لجين المراسل.
أخيرا ، يتم إحراز تقدم في هندسة المسارات البيولوجية الكاملة في الكائن الحي المستهدف. هنا ، تم عزل كل جين من مسار التخليق الحيوي للمضاد الحيوي الإريثروميسين من البكتيريا المضيفة ، Saccharopolyspora erythraea ، عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ودمجها في تركيبات شبيهة بالمشغل حيث يتم وضع سلسلة من الجينات تحت السيطرة بواسطة نفس العناصر التنظيمية للسماح بالتعبير الأمثل. ثم تم تحويل هذه التركيبات إلى الإشريكية القولونية لإعادة تشكيل مسار التوليف ، ويمكن بعد ذلك تنقية المنتج المنتج غير المتجانس واختباره من أجل الوظيفة.
لقد شاهدت للتو نظرة عامة على JoVE عن الهندسة الوراثية. في هذا الفيديو ، ناقشنا تاريخ الهندسة الوراثية ، وفحصنا الأسئلة الرئيسية والأدوات في هذا المجال ، وقدمنا عدة أمثلة لتطبيقات الهندسة الوراثية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What key discoveries established DNA as the genetic material?
Frederick Griffith's 1928 experiments with bacteria suggested a transforming principle. Oswald Avery, Colin Macleod, and Maclyn McCarty identified DNA as responsible for transformation in 1944. Alfred Hershey and Martha Chase confirmed in 1952 that viral DNA, not protein, transmits genetic information during bacterial infection using radioactively labeled bacteriophage.
Q2: How do restriction enzymes and DNA ligases work together in genetic engineering?
Restriction enzymes cut DNA at specific sequences, breaking it into fragments. DNA ligases then join these fragments in desired orders to create new plasmids. This restriction enzyme-based cloning method was foundational for generating genetic constructs before newer techniques like recombineering and gene targeting emerged.
Q3: What are the main methods for delivering DNA into cells?
Transformation and transfection use divalent cations like calcium to increase cell membrane permeability for naked DNA uptake. Electroporation applies electric fields for the same purpose. Lipid nanoparticles surround DNA and fuse with membranes, while transduction uses viral vectors like lentiviruses to transfer genetic material into cells.
Q4: How do homologous recombination and genome editing differ in targeting genes?
Homologous recombination allows integration into specific genomic sites by matching DNA sequences, enabling precise gene targeting. Genome editing uses custom-designed nucleases to generate double-strand breaks at specific loci, greatly improving targeting efficiency. Both techniques minimize off-target effects compared to random DNA integration.
Q5: What is the difference between knockout mice and transgenic mice?
Transgenic mice contain inserted foreign genes, like SV40 viral DNA, and can pass these genes to offspring. Knockout mice have specific genes rendered nonfunctional through homologous recombination. Rudolf Jaenisch created the first transgenic mouse in 1973, while Mario Capecchi and Oliver Smithies generated the first knockout mouse in 1989.
Q6: How is genetic engineering applied to treat cancer using gene therapy?
Researchers target cancer cells that over-express surface receptors using adenoviral vectors. In bladder cancer models, topical delivery of the vector to cancer cells enables successful gene transfer. Luciferase reporter genes confirm successful delivery, demonstrating how gene therapy can target specific cancer cell populations for therapeutic intervention.
Q7: What challenges remain in applying genetic engineering to complex agricultural problems?
Simple traits like herbicide resistance are achievable, but complex problems such as stress tolerance require modifying multiple pathways simultaneously. Safe and efficient delivery of genetic constructs to target cells remains challenging. Additionally, minimizing off-target effects and ensuring long-term stability of modifications are critical considerations for successful agricultural applications.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:49
Historical Highlights
3:41
Key Questions
5:25
Prominent Methods
8:09
Applications
10:11
Summary