في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر

الهدف العام من هذا الإجراء هو التحقيق والتنبؤ بفعالية أنظمة توصيل الأدوية القائمة على GnRH في مزارع الخلايا السرطانية البشرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال العلاج المستهدف المضاد للسرطان ، مثل مدى كفاءة خلايا أنواع السرطان البشري المختلفة للأدوية المضادة للسرطان المستهدفة GnRH. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم نظائر GnRH جديدة ذات علامات فلورية تسمح بالاستخدام المتزامن للفحص المجهري متحد البؤر وتحليل قياس التدفق الخلوي.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المضاد للسرطان لأن مستقبلات GnRH يتم التعبير عنها بشكل كبير في العديد من أنواع الخلايا السرطانية ، مما يتيح استهدافها بشكل انتقائي. ستظهر الإجراء بيانكا جوربي ، طالبة دكتوراه من مختبري. للبدء ، قم بإزالة الوسط المزروع من كل من الآبار السبعة للشريحة المجهرية المصنفة.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى بئر التحكم السلبي و 250 ميكرولترا من وسائط معالجة البذور المسخنة مسبقا لكل من الآبار الستة المتبقية. احتضان الشريحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. بعد خمس ساعات من الحضانة ، قم بشفط الوسط من كل بئر واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من محلول التثبيت في كل بئر واحتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بمجرد إصلاح الخلايا ، تخلص من محلول التثبيت واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS. أضف 250 ميكرولترا من محلول مسبار الفلورسنت المكون من خمسة ميكرومولار المحضر في PBS في كل بئر واحتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد إزالة محلول مسبار الفلورسنت ، اغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من PBS. أخيرا ، أضف ثلاث إلى أربع قطرات من وسط التركيب في كل بئر. احتفظ بالشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تصويرها تحت المجهر.

قم بإزالة الوسط المزروع من كل من الآبار الخمسة للشريحة المجهرية المصنفة. بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى بئر التحكم السلبي وإلى البئر الثاني مع الخلايا غير المعالجة. قم بمعالجة الخلايا في الآبار الثلاثة المتبقية باستخدام وسائط المعالجة المسخنة مسبقا التي تحتوي على 10 ميكرومولار GnRH FITC.

احتضان الشريحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسائط فقط من الخلايا المعالجة واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من الوسط الكامل المسخن مسبقا. بعد ذلك ، قم بإزالة وسط الغسيل.

ثم أضف 250 ميكرولترا من الوسط الكامل المسخن مسبقا في كل من الآبار الثلاثة. احتضان الشريحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، تخلص من الوسائط من جميع الآبار الخمسة واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS.

بعد ذلك ، قم بإزالة PBS وإصلاح الخلايا ب 250 ميكرولتر من محلول التثبيت في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، تخلص من محلول التثبيت واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS. أضف 250 ميكرولترا من محلول الحجب في كل بئر واحتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

شفط محلول مانع من كل بئر باستثناء التحكم السلبي. بعد غسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS ، أضف 250 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة الأولية لكل بئر. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في مكان مظلم.

قم بإزالة المحاليل من كل من الآبار الخمسة وغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS. ثم قم بإزالة PBS وأضف 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية. احتضان الشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في الظلام.

استنشق المحلول من كل بئر واغسل الخلايا ب 250 ميكرولتر من PBS. قم بإزالة PBS الغسيل ثم أضف 250 ميكرولترا من PBS الذي يحتوي على خمسة مسبار فلوري ميكرومولار في كل بئر. احتضن الشريحة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة محلول مسبار الفلورسنت من كل بئر واغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من PBS. أخيرا ، أضف ثلاث إلى أربع قطرات من وسط التركيب في كل بئر. احتفظ بالشريحة في الظلام في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تصويرها تحت المجهر.

قم بتصوير الخلايا تحت مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوب. قم بتشغيل الليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر. تحقق من تضخيم الليزر وحجم الثقب.

تصوير عينة التحكم السلبية. قم بتحسين الإشارة التي لوحظت للنواة واضبط إشارة FITC و Alexa 546 بحيث تكون قريبة من الصفر. ثم ، باستخدام نفس المعلمات ، قم بتصوير العينات المعالجة.

تخلص من الوسط الكامل من جميع الآبار السبعة للوحة الثقافة المصنفة. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من الوسط الكامل المسخن مسبقا في بئر التحكم السلبي ومليلتر واحد من وسائط المعالجة المسخنة مسبقا إلى الآبار الستة المتبقية. احتضان اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات.

بعد التخلص من الوسط من جميع الآبار ، اغسل الخلايا بعناية مرتين باستخدام ملليلترين من PBS. قم بإزالة PBS ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Trypsin EDTA في كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا ، الأمر الذي سيستغرق حوالي 10 دقائق.

باستخدام مليلتر واحد من الوسط الكامل ، قم بتحييد التربسين في كل بئر ورج الطبق. بعد ذلك ، قم بتعليق الخلايا عن طريق سحب العينات اللطيف. انقل المعلقات إلى أنابيب FACS منفصلة وقم بالطرد المركزي للعينات عند 150 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة أربع دقائق.

صب المواد الطاففية بعناية. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من PBS المثلج إلى كل أنبوب FACS وأعد تعليق الخلايا برفق. احتفظ بالأنابيب على الجليد حتى يتم تحليلها بواسطة FACS.

يتم تقديم تحليل امتصاص GnRH في خلايا سرطان البلعوم. أدى العلاج لمدة خمس ساعات باستخدام ميكرومولار واحد من مركب الفلورسنت من GnRH إلى تناول طفيف ، ولكن يمكن تمييزه يتجلى في إشارة فلورية خضراء موضعية في خلايا سرطان البلعوم. أدت الزيادة الإضافية في الجرعة المعقدة إلى تعزيز الامتصاص ، مما يدل على الاعتماد على جرعة امتصاص GnRH في خلايا سرطان البلعوم.

تم تحليل امتصاص GnRH المعتمد على المستقبلات والتوزيع الخلوي للترابط في مستقبله في خلايا سرطان الرئة عن طريق العلاج المتزامن بمركب GnRH الفلوري وتلوين مستقبلات GnRH من النوع الأول والنوى. أظهرت النتائج أن مستقبلات GnRH من النوع الأول مرتبطة بغشاء الخلية بينما يتم استيعاب بروتين GnRH في الخلايا ويبقى في السيتوبلازم. كما تمت دراسة امتصاص GnRH في خلايا سرطان البلعوم باستخدام تحليل FACS.

تظهر النتائج أن امتصاص GnRH الذي لوحظ عندما عولجت الخلايا بميكرومولار واحد من GnRH المترافق قد تم تعزيزه بقوة عندما تمت زيادة الجرعة المطبقة على الخلايا إلى 10 ميكرومولار. بمجرد إتقانها ، يمكن الانتهاء من هذه التقنية في ثماني ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر حماية العينات المعالجة والأصباغ الفلورية من الضوء المباشر.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قابلية الخلية للحياة أو فحوصات موت الخلايا المبرمج من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مدى كفاءة الدواء المستهدف GnRH في تثبيط نمو نوع معين من السرطان. بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علاج السرطان لاستكشاف فعالية أنظمة توصيل الأدوية القائمة على GnRH في التصاق الخلايا السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام هذه المقترنات GnRH المصنفة بالفلورسنت لاستكشاف قابلية الخلايا السرطانية للعلاجات المستهدفة GnRH.