What is homologous recombination and how does it differ from classical molecular cloning?

Homologous recombination is the exchange of DNA between molecules based on stretches of similar or identical sequences. Unlike classical molecular cloning, which requires specific restriction enzyme sites to generate compatible ends, homologous recombination avoids this limitation. This makes recombineering a more efficient and cost-effective approach for engineering and recombinant dna technology, especially when restriction sites are unavailable around the region of interest.

What are the key components needed to perform a recombineering experiment?

Recombineering requires a recombination-competent organism, such as yeast Saccharomyces cerevisiae or E. coli expressing Red proteins from bacteriophage lambda. Researchers also need genomic libraries containing long DNA fragments, with bacterial artificial chromosomes (BACs) being commonly used because they carry insert sizes between 150-350 kilobases. These components enable efficient homologous recombination between vectors and inserts.

How are homology arms designed and used in the recombineering protocol?

Homology arms are oligonucleotides containing 30-50 basepair homologous regions designed to flank the target sequence. These serve as primers in PCR reactions to generate DNA cassettes that modify the gene of interest. In advanced procedures like subcloning plus insertion (SPI), homology arms can be up to 180 bp long to increase recombination efficiency, making the process more flexible and reliable.

What is the purpose of a retrieval vector in creating a gene-targeting construct?

A retrieval vector is linearized and amplified using primers containing homology arms that span several kilobases around the modification site. When transformed into the BAC clone, the vector undergoes gap-repair by retrieving the modified sequence from the BAC. This produces a gene-targeting vector containing the modified sequence plus regions homologous to genomic DNA, which can then be introduced into embryonic stem cells for targeted genome modification.

How can recombineering be applied to study protein interactions in bacteria?

Researchers design cassettes encoding sequential peptide affinity tags and selection markers like kanamycin resistance, then recombineer them into the 3' end of target genes in Red-competent E. coli. Successful recombinants are isolated using selective media. The tagged protein complexes are then biochemically purified using proteins that bind to the tags and analyzed by mass spectrometry to identify interaction partners.

What advantages does recombineering offer for modifying parasite genomes?

Recombineering enables precise genome modification in parasitic organisms like Toxoplasma gondii. A targeting vector with genomic sequences flanking the gene of interest is recombineered in yeast, then linearized and electroporated into parasites. The parasite's homologous recombination machinery replaces the genomic sequence with the engineered version, effectively deleting or modifying target genes. PCR confirms successful recombination events.

Why is proper homology arm design critical for the success of subcloning plus insertion (SPI)?

In SPI, gap repair and cassette insertion occur simultaneously, requiring precise homology arm design to ensure efficient recombination. Homology arms in SPI are longer, up to 180 bp compared to conventional recombineering, increasing recombination efficiency and success rates. After PCR incorporation into subcloning plasmids and insertion cassettes, they are transformed into Red-expressing BAC clones and verified by detection and quantification nucleic acids or restriction digest analysis.

إعادة التركيب واستهداف الجينات

0 مشاهدة08:56 دقيقة

أدى الاستنساخ عن طريق إعادة التركيب المتماثل ، أو إعادة التركيب ، إلى تحسين كبير في قدرة الباحثين على إجراء هندسة وراثية عالية الإنتاجية. يتطلب الاستنساخ الجزيئي الكلاسيكي هضم النواقل والإدخالات بنفس إنزيمات التقييد لتوليد نهايات متوافقة ل "إعادة التركيب" ، ولكن بشكل خاص عند محاولة عزل منطقة من تسلسل أطول ، مثل امتداد الحمض النووي الجيني ، لا توجد دائما إنزيمات تقييد تقطع بشكل فريد حول المنطقة ذات الاهتمام ، وليس داخل المنطقة أو في أي مكان آخر في التسلسل. من خلال تجنب الحاجة إلى مواقع التقييد هذه ، يوفر إعادة التركيب طريقة أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لعمل تركيبات الهندسة الوراثية.

في هذا الفيديو ، سوف نقدم مبادئ إعادة التركيب الجيني ، ونقدم بروتوكولا عاما لإعادة تجميع ناقل استهداف الجينات ، ونناقش العديد من تطبيقات هذه التقنيات.

أولا ، دعنا نناقش ماهية إعادة التركيب وكيف يمكن تطبيقها.

يستلزم إعادة التركيب الجيني تبادل المعلومات بين جزيئات الحمض النووي. في "إعادة التركيب المتماثل" ، يتم تبادل امتدادات كبيرة نسبيا من تسلسلات الحمض النووي المتشابهة أو المتطابقة. تستخدم الخلايا هذه العملية لإصلاح فواصل الخيوط المزدوجة ، كما أن حقيقيات النوى التي تتكاثر جنسيا تقوم بذلك بين الكروموسومات المتجانسة أثناء الانقسام الاختزالي لزيادة التنوع الجيني.

تم تسخير إعادة التركيب المتماثل لعدد من الأغراض التجريبية ، بما في ذلك تعديل مواقع داخلية محددة في الخلايا - تسمى "استهداف الجينات". يتم تطبيقه أيضا على هندسة التركيبات الجينية ، وهي عملية تسمى "إعادة التجميع" ، وهي مفيدة بشكل خاص لإجراء تعديلات على مساحات كبيرة من الحمض النووي لاستهداف جينوم الكائن الحي. للقيام بذلك ، يمكن للباحثين الاستفادة من "المكتبات الجينومية" ، أو مجموعات من النواقل التي يحتوي كل منها على شظايا طويلة من الحمض النووي الجيني. تم إنشاء أنواع مختلفة من المكتبات ذات السعات المختلفة ، والتي يتم نشرها عادة في نسخ بكتيرية ، ويمكن طلبها من مستودعات تجارية أو غير ربحية. يطلق على أحد أكثر أنواع المكتبات الجينومية استخداما اسم الكروموسوم الاصطناعي البكتيري أو BAC ، والذي يمكن أن يحمل حجم إدراج يتراوح بين 150-350 كيلو قاعدة.

من أجل إعادة تجميع البناء ، يحتاج العلماء إلى كائن حي يحدث فيه إعادة التركيب المتماثل. الخميرة خميرة الخميرة هي بشكل طبيعي "مؤهلة لإعادة التركيب" ويمكنها بسهولة إجراء إعادة تركيب متماثل بين ناقل وإدخال. يستخدم نظام آخر شائع التطبيق البروتينات "الحمراء" من العاثية لامدا ، والتي يعاد تشكيلها في بكتيريا الإشريكية القولونية . يمكن إعادة تجميع النواقل إما في السلالات البكتيرية التي تعبر عن اللون الأحمر التي تم إنشاؤها مسبقا ، أو يمكن تحويل مكونات النظام الأحمر المشفر بالبلازميد مع ركائز إعادة التجميع إلى البكتيريا.

الآن ، دعنا نتعرف على بروتوكول لإنشاء ناقل استهداف الجينات عن طريق إعادة التجميع.

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء فأر معدل وراثيا مع تغييرات مستهدفة لجين معين. باختصار ، يتم إجراء التعديلات المرغوبة على الجين ذي الأهمية في BAC. يتم "استرداد" التسلسل المعدل في ناقل استهداف ، ويتم نقل هذا الناقل إلى خلايا جذعية جنينية لاستهداف الجينات. يمكن بعد ذلك استخدام الخلايا الجذعية لتوليد المعدل وراثيا. للحصول على تعليمات حول هذا الإجراء النهائي ، يرجى الرجوع إلى فيديو JoVE Science Education "الهندسة الوراثية للكائنات الحية النموذجية"

للبدء ، يتم تحديد واستنساخ BAC الذي يحتوي على التسلسل الجينومي ذي الأهمية وطلبه. بعد ذلك ، تم تصميم أذرع التماثل ، أو قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على 30-50 منطقة متجانسة من الزوج الأساسي. تستخدم هذه قليل النوكليوتيدات كبادئات في تفاعلات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتوليد "أشرطة" الحمض النووي المستخدمة لتعديل الجين محل الاهتمام. تحتوي هذه الكاسيتات عادة ، على سبيل المثال ، على جينات مقاومة للمضادات الحيوية يمكن أن تعمل كعلامات اختيار ، والتي يمكن تضخيمها بسهولة من العديد من البلازميدات المتاحة للجمهور. ثم يتم تحويل استنساخ بكتيريا BAC ، على سبيل المثال عن طريق التثقيب الكهربائي ، مع بلازميد يشفر مكونات النظام الأحمر ، متبوعا بأشرطة تحتوي على ذراع التماثل. ثم يتم تحضين البكتيريا عند درجة الحرارة المناسبة للحث على إعادة التركيب.

لاستعادة التسلسل المعدل من BAC ، يتم خطية متجه "الاسترجاع" وتضخيمه باستخدام بادئات تحتوي على أذرع تماثل تغطي عدة كيلو قواعد حول موقع التعديل. يتم تحويل هذا العمود الفقري الناقل إلى استنساخ بكتيري BAC ، ويتم تحفيز إعادة التركيب مرة أخرى. سيتم "إصلاح الفجوة" المتجه عن طريق "استرداد" التسلسل المناسب من BAC. ينتج عن هذا ناقل استهداف الجينات يحتوي على التسلسل المعدل محل الاهتمام ، بالإضافة إلى المناطق المتماثلة مع الحمض النووي الجيني المحيط بالتسلسل المعدل. يمكن بعد ذلك تنقية هذا الناقل وخطيته وإدخاله في الخلايا الجذعية الجنينية حيث ستستهدف آلية إعادة التركيب المتماثلة الذاتية التسلسل المعدل إلى الموضع المقابل ، وبالتالي تغيير الجينوم المضيف.

دعونا الآن نلقي نظرة على بعض تطبيقات التقنيات الهندسية القائمة على إعادة التركيب.

أولا ، يمكن للباحثين استخدام إعادة التركيب لهندسة الجينوم البكتيري بسرعة وسهولة ، على سبيل المثال ، لدراسة مجمعات البروتين. هنا ، تم تصميم كاسيت يشفر علامة تقارب الببتيد المتسلسلة بالإضافة إلى علامة اختيار مقاومة الكاناميسين ليتم إعادة تجميعها في نهاية 3 ¢ من الجين محل الاهتمام. ثم تم إدخال هذا المتجه في Red "المختص بإعادة التركيب" الإشريكية القولونية ، وتم عزل المؤتلفات الناجحة باستخدام وسائط انتقائية. تم تنقية مجمعات البروتين الموسومة كيميائيا حيويا باستخدام البروتينات التي ترتبط بقوة بالعلامات ، وتم تحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي لتحديد شركاء التفاعل للبروتين محل الاهتمام.

يمكن أيضا استخدام إعادة التركيب واستهداف الجينات لتعديل جينوم الكائنات الطفيلية ، مثل الطفيلي الإلزامي داخل الخلايا التوكسوبلازما جوندي ، الذي يسبب مرض داء المقوسات. في هذه الدراسة ، تم إعادة تجميع ناقل الاستهداف في الخميرة ، حيث تم وضع التسلسلات الجينومية التي تحيط بالجين المعني حول علامة الاختيار. ثم تم خطية الناقل وتحويله بالكهرباء إلى الطفيليات. تم استخدام الحد من طلاء التخفيف في الوسائط الانتقائية لعزل المؤتلفات الناجحة ، حيث حلت آلية إعادة التركيب المتماثل للطفيلي محل التسلسل الجيني بالتسلسل المصمم هندسيا ، وبالتالي حذف الجين محل الاهتمام. أكد تفاعل البوليميراز المتسلسل للمنطقة المستهدفة أحداث إعادة التركيب الإيجابية.

أخيرا ، تم ابتكار إجراء يعرف باسم الاستنساخ الفرعي بالإضافة إلى الإدراج ، أو SPI ، حيث يحدث إصلاح الفجوة وإدخال الكاسيت في وقت واحد ، مما يجعل عملية إعادة التركيب أبسط وأكثر مرونة. من الأمور الحاسمة لنجاح هذه العملية التصميم الصحيح لأذرع التماثل المتعددة ، والتي تصل إلى 180 نقطة أساس ، أطول من إعادة التركيب التقليدية لزيادة كفاءة إعادة التركيب. بعد دمج أذرع التماثل في أشرطة البلازميد والإدخال الاستنساخ الفرعي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، تم تحويلها معا إلى استنساخ BAC معبر باللون الأحمر ، وتم إحداث إعادة التجميع. ثم تم تحديد التركيبات المعاد تجميعها بنجاح عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تحليل ملخص التقييد.

لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إعادة التجميع. في هذا الفيديو، ناقشنا مبادئ إعادة التركيب وكيف يمكن استخدامها في الهندسة الوراثية، وبروتوكول لمشروع إعادة التجميع، وأخيرا العديد من تطبيقات هذه التقنيات. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!

واحدة من أكثر الأدوات استخداما في علم الأحياء الحديث هي الاستنساخ الجزيئي باستخدام إنزيمات التقييد ، والتي تخلق نهايات متوافقة بين شظايا الحمض النووي…