نموذج وينف - غير مكلفة و تراكتابل مصغر من المخاط توصيل القصبات لدراسة الأحياء الدقيقة من التهابات الرئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو محاكاة بيئة الرئة وتنمية المسببات المرضية بطريقة أكثر تشابهاً مع الحالة التي تسبب فيها المرض. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال ميكروبيولوجيا الممرات الهوائية، مثل كيفية تفاعل المسببات المرضية البكتيرية المتنوعة في رئة المصاب بالتليف الكيسي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالتحكم السهل في الظروف التجريبية.

لملاحظة الاستجابات الميكروبية بشكل مشابه لما يحدث في القصبات الرئوية الفعلية، سيقوم ويل كومستوك من مختبرنا بتوضيح الإجراء. لتحضير وسط البلغم الاصطناعي، اخلط 16 milliliters من محلول مخزون الميوسين المحضر مسبقاً، و 2 milliliters من محلول مخزون كلوريد البوتاسيوم، و 2 milliliters من محلول مخزون كلوريد الصوديوم، و 200 µL من مستحلب صفار البيض، و 5.6 milliliters من محلول مخزون DNA، و 120 µL من محلول مخزون الفيريتين، و 5.78 milliliters من محلول الأحماض الأمينية الأساسية، و 5.78 milliliters من محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 2.44 milliliters من الماء المعقم.

يعد التحضير الدقيق لوسط بلغم اصطناعي معقم أمراً بالغ الأهمية، حيث يمكن لأي تلوث أن يغير من النشاط البكتيري في الأنابيب الشعرية المحضنة في مراحل لاحقة. بعد الرج بلطف للمزج، انقل خمسة milliliters من الوسط باستخدام الماصة إلى ثماني أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 milliliter.

يمكن الآن تعديل الوسط لتحقيق الظروف الكيميائية المطلوبة. على سبيل المثال، تم تغيير قيمة الـ PH في الأوساط الموضحة هنا وإضافة أصباغ لتعكس درجات حموضتها المختلفة. بعد ذلك، وتحت غطاء حيوي معقم، أضف 900 µL من الوسط إلى كل أنبوب من ثمانية أنابيب طرد مركزي دقيقة معقمة سعة 1.5 mL.

قم بتجنيس عينات البلغم التي تم جمعها مسبقاً باستخدام محقنة سعة ثلاثة ملليلتر عن طريق سحب البلغم ودفعه بشكل متكرر حتى يصل إلى قوام ناعم. أضف 100 µL من البلغم المجنس إلى كل أنبوب من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الثمانية. بعد ذلك، قم برج الأنابيب باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) لضمان الخلط الكافي.

قم بتسمية ثمانية أنابيب طرد مركزي معقمة إضافية سعة 15 milliliter وفقاً لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخاصة بالوسط الذي تم تحضيره مسبقاً. ستكون هذه هي أنابيب الحضن. استخدم محلول ethanol بتركيز 70% لتعقيم منشفة ورقية واتركها حتى تجف.

قم بتمزيق المنشفة إلى قطع يبلغ حجم كل منها حوالي أربع بوصات مربعة. بعد ذلك، قم بتجعيد قطعة واحدة في قاع كل أنبوب تحضين. ومع وجود كتلة واحدة من الورق في قاع كل أنبوب تحضين، استخدم 1 milliliter من الماء المعقم لترطيب كل كتلة قليلاً لإنشاء بيئة رطبة داخل الأنبوب.

لكل أنبوب من الوسط الغذائي، املأ ثلاثة أنابيب شعرية زجاجية بالوسط عن طريق وضع أحد طرفي الأنبوب في الوسط وإمالته أفقيًا، مما يسمح للخاصية الشعرية بتوجيه الوسط إلى داخل الأنبوب. أوقف عملية الملء بوضع إصبع مغطى بقفاز بلطف فوق الطرف المفتوح للأنبوب، ثم أغلق الطرف الآخر من الأنبوب عن طريق ضغطه لأسفل في كتلة من مادة سد الأنابيب الشعرية (capillary putty sealant).

ضع كل مجموعة مكونة من ثلاث أنابيب شعرية في أنابيب حضانة سعة 15 milliliter بحيث تكون الجهة المختومة بالمعجون متجهة للأسفل. بعد ذلك، أغلق الأنابيب بالأغطية وتأكد من وضع الملصقات التعريفية عليها. تُستخدم هذه الأنابيب الشعرية الثلاث لتكرار كل حالة ضابطة.

عندما تمتلئ جميع أنابيب الحضن بأنابيب الشعيرات المخصصة لها، توضع الحوامل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية بحيث يتم تحضين الأنابيب بشكل أفقي لضمان عدم هروب أي غاز متولد من الطرف المفتوح. تُحضن الأنابيب لمدة 48 ساعة.

أخرج الأنابيب من الحاضنة مع الحرص على إبقائها في وضع أفقي. اسحب الأنابيب الشعرية بعناية من أنابيب التحضين، مع الحفاظ على فصل كل مجموعة مكونة من ثلاثة أنابيب عن المجموعات الأخرى. رتب الأنابيب الشعرية بجانب بعضها البعض على صندوق إضاءة بحيث تكون جميعها مصطفة وتكون محتويات الأنابيب مرئية ومضاءة من الأسفل.

اترك فجوة كل ثلاثة أنابيب للفصل بين الظروف الكيميائية المختلفة. بعد ذلك، ركز الكاميرا على الأنابيب مباشرة من الأعلى بحيث تكون جميع الأنابيب مرئية في مجال الرؤية، وبحيث يوفر الضوء المنبعث من صندوق الإضاءة تبايناً كافياً وتصوراً واضحاً لألوان صبغات الأنابيب. لاستخراج محتويات الأنابيب من أجل التحليلات اللاحقة، قم بإزالة مجموعة واحدة من الشعيرات الثلاثية المكررة من صندوق الإضاءة في كل مرة. أدخل إبرة غير مدببة مقاس 25 gauge وبطول 0.5 inch في الطرف المسدود من الأنبوب الشعيري لكسر الختم.

بعد ذلك، اقلب الأنبوب الشعري رأساً على عقب للسماح للوسط بالتنقيط من الجزء العلوي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. إذا لم ينقط الوسط، استخدم ماصة سعة 200 microliter لطرد الوسط من الأنبوب عن طريق الضغط على مكبس الماصة عند إدخالها في طرف الأنبوب الشعري. وكما هو موضح هنا، عندما لم تضاف عينات بلغم إلى الوسط، كان التغيير الوحيد الملحوظ عبر طيف pH بعد 48 ساعة من الحضن هو انخفاض طفيف في حجم الوسط نتيجة لتبخر بسيط.

أظهرت الأنابيب الشعرية الملقحة تغيرات في الحجم، وظهور فقاعات غازية، وتغيراً في اللون، وظهور رواسب معتمة. تشير هذه النتائج إلى أن البكتيريا والميكروبات الأخرى الموجودة في البلغم المضاف قادرة على النمو والتغير داخل الوسط الاصطناعي. وبعد عملية الحضن، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الميتابولوميات وتسلسل DNA للإجابة على أسئلة إضافية حول سلوك الميكروبات التي تنمو في الأنابيب الشعرية.

يُعد نظام winCF طريقة مبتكرة لدراسة نشاط الميكروبيوم الرئوي؛ وهو أمر بالغ الأهمية للعديد من الأمراض بما في ذلك التليف الكيسي (CF)، ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، والربو، وغيرها.