Name: تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: تعلم تقنيات استحثاث الشيخوخة الخلوية وتقييم علاماتها باستخدام الخلايا الليفية البشرية. توفر هذه البروتوكولات أدوات شاملة لمراقبة الشيخوخة في نماذج مختلفة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة. الكتاب أود أن أشكر ميريام غوروسب وقطب عبدالمحسن بالنسبة لكثير من المناقشات المفيدة حول الشيخوخة وقطب عبدالمحسن للأيضا قراءة نقدية للمخطوطة. كما نشكر أعضاء المختبر لدينا، خاصة دوغلاس دلوزين لقراءة نقدية للمخطوطة.

<ol><li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+Vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+when+bad+things+happen+to+good+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).</li>
<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Pospelova, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudo-DNA+damage+response+in+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Pseudo-DNA damage response in senescent cells.</a> Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).</li>
<li>Narita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb-mediated+heterochromatin+formation+and+silencing+of+E2F+target+genes+during+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence.</a> Cell. 113 (6), 703-716 (2003).</li>
<li>Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signals+and+pathways+activating+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signals and pathways activating cellular senescence.</a> Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%2C+tumor+suppression%2C+and+organismal+aging%3A+good+citizens%2C+bad+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors.</a> Cell. 120 (4), 513-522 (2005).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Induces+Senescence+with+a+Distinct+Secretory+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype.</a> Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
<li>Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+senescence-associated+secretory+phenotype+%28SASP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP).</a> Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).</li>
<li>Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+microRNAs%3A+individual+gene+repressors%2C+global+translation+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers.</a> Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).</li>
<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
<li>Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cell+and+organ+senescence+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing cell and organ senescence biomarkers.</a> Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+Manipulation+of+Telomerase+Expression+and+Telomere+Length%3A+implications+for+the+ionizing+radiation+response+and+replicative+senescence+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells.</a> J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).</li>
<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cell+Senescence+in+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li>
<li>Nyunoya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+Smoke+Induces+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence.</a> J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).</li>
<li>Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Transforming+Growth+Factor-%CE%B2+Signaling+Delays+Cellular+Senescence+and+Preserves+the+Function+of+Endothelial+Cells+Derived+From+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells Transl Med. , (2016).</li>
<li>Senturk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+induces+senescence+in+hepatocellular+carcinoma+cells+and+inhibits+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth.</a> Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+approach+for+monitoring+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An integrated approach for monitoring cell senescence.</a> Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).</li>
<li>Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+cellular+senescence%3A+implications+for+immortalization+of+normal+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).</li>
<li>Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase--an+indicator+of+the+maturational+stage+of+mouse+and+human+mononuclear+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes.</a> J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هنا، التي وصفناها طرق تنسخي والحمض النووي الضرر الناجم عن الشيخوخة باستخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين تقنيات لقياس البروتين ومستويات مرنا من مختلف البروتينات المرتبطة الشيخوخة، فضلا عن تلطيخ لSA-β-غال ولDNA-الضرر علامة γ-H2AX. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها على نطاق واسع لتقييم الظواهر هرمة سواء في التجارب المختبرية والحية، على الرغم من أن العديد من المحاذير وجود لوصف الشيخوخة في الجسم الحي 20. ...

منذ أكثر من نصف قرن، ووصف Hayflick وزملاؤه كيف خلايا تتكاثر هو دون تغيير في الثقافة، ولكن فقط لفترة محدودة من الوقت 1. زراعة على المدى الطويل من الخلايا الليفية الإنسان تسبب الخلايا لوقف الانتشار. ومع ذلك، فإنها كانت نشطة عملية الأيض، وهذا ما يسمى الشيخوخة الخلوية. الشيخوخة يمكن أن تكون مفيدة لتثبيط تكون الأورام، ولكن أيضا يمكن أن يكون ضارا، كما هو يعتقد أن تساهم في فقدان القدرة على التجدد الذي يحدث مع الشيخوخة 2 و 3. وقد تبين أن خلايا هرمة تتراكم في الأنسجة كما البشر سن 4 و قد تورطت في عدد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، التئام الجروح، وإصلاح الأنسجة، والمتعلقة بالعمر التهاب 2. الركض المستمر للخلايا في ثقافة يدفع الشيخوخة تنسخي، والتي تم ربطهالالتيلومير الاستنزاف وعدم الاستقرار الجيني. الضغوط الخلايا المختلفة، بما في ذلك الحمض النووي من التلف والمسرطنة، ويمكن أيضا أن يسبب الشيخوخة 3. الشيخوخة التي تسببها العوامل الأخرى من الاستنزاف التيلومير وغالبا ما تسمى التوتر الناجم عن الشيخوخة المبكرة أو وعموما يعتمد على INK4A P16 / الروبيديوم مسار 5. وعلى الرغم من الانتشار، تظهر خلايا هو دون تغيير عادة المغزل في الشكل، ويمكن تحديد خلايا هرمة وجود بعض الخصائص، بما في ذلك شقة، مورفولوجيا كبير وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال) (الشكلان 1 و 2). كما تتراكم خلايا هرمة علامات الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX (الشكل 3) 6، وربما، المرتبط الشيخوخة المغاير بؤر (SAHF) (الشكل 4) 7. خلايا هرمة لديهم مستويات أعلى من المنظمين دورة الخلية، بما في ذلك ع<html> 16 (INK4A P16) و / أو P21 والبروتين p53 (الشكل 5) 8، 9. وعلاوة على ذلك، أظهرت بيانات حديثة أن خلايا هرمة يمكن أن يكون لها آثار غير المتمتعة بالحكم الذاتي عن طريق إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات وكيموكينات يسمى المرتبطة الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP) 10. على الرغم من أن هذه الظاهرة SASP قد تختلف من نوع من الخلايا إلى نوع من الخلايا، بصفة عامة، ويتجلى ذلك من خلال زيادة انترلوكين 6 (IL-6)، IL-8،-محببة بلعم مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF)، النمو- α منظم الجين الورمي (GRO-α)، واللائحة العامة للمنظمة، β، من بين أمور أخرى (الشكل 6). الإجهاد معين أو الضرر الذي يسبب الشيخوخة قد تؤثر أيضا على النمط الظاهري إفرازية 11 و 12 و 13. يمكن الكشف عن SASP عن طريق قياس مستويات البروتينات يفرز باستخدام ELISAs أو صفائف خلوى / البروتينالصورة = &quot;XREF&quot;&gt; 10 و 14. على الرغم من أن آليات ما بعد النسخي يمكن تنظيم مستويات البروتين SASP 11، 15، 16، 17، والتغيرات في مستويات مرنا ويمكن أيضا أن يتم الكشف في كثير من الحالات. هذه التغيرات عادة ما تكون أكثر حساسية وأسهل لتحديد من قياسات مستوى البروتين. ويمكن أيضا أن يتم تقييم علامات هرمة الأخرى، بما فيها بؤر الحمض النووي من التلف المستمر النووي، ودعا شرائح DNA مع بعض التعديلات لونين تعزيز الشيخوخة (DNA-ندوب) 18، والعديد من علامات أخرى 3 و 19 و 20. هنا، نحن تصف التقنيات الشائعة لإحداث الشيخوخة في الخلايا في الثقافة وأيضا لقياس العديد من علامات الشيخوخة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX، SAHF، والبروتين ومرنا من senesceجزيئات الامتحانات التنافسية الوطنية المصاحب.

<table><tbody><tr><td>16٪ هلام تريس جلايسين</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>حمض الفينول ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300</td></tr> تخفيف <tr><td>رافعات الخلايا</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>مكشطة الخلية</td></tr><tr><td>ECL المضادة للفأر HRP الجسم المضاد المرتبط</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blouting Substrate</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>المجسات الجزيئية</td><td>MP01306</td><td>مخزون 5 مجم / مل في dH 2O</td></tr><tr><td>الجسم المضاد GAPDH</td><td>سانتا كروز</td><td>sc-32233</td><td>1: 1،000 - 5،000</td></tr> تخفيف <tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 ثنائي ميثيل K9 الجسم المضاد أحادي النسيلة</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1: 500 التخفيف</td></tr><tr><td>البشري IL-6 Quantikine ELISA الفحص</td><td>R & أنظمة D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>البشرية IL-8 Quantikine ELISA الفحص</td><td>R & أنظمة D</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>البشرية GROa Quantikine ELISA الفحص</td><td>R & أنظمة D</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-dimethylformamide &nbsp ؛</td><td>سيجما</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 الجسم المضاد أحادي النسيلة</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1: 500 التخفيف</td></tr><tr><td>p21 الجسم المضاد أحادي النسيلة</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1: 750 التخفيف</td></tr><tr><td>p53 الجسم المضاد أحادي النسيلة</td><td>سانتا كروز</td><td>sc-126</td><td>1: 500 استنساخ التخفيف DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC مترافق الجسم المضاد</td><td>إشارات الخلية</td><td>9719</td><td>1: 2،000 التخفيف</td></tr> <tr><td>< م > الطاقة < م > SYBR الأخضر PCR ماستر ميكس &nbsp ؛</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>علامات الوزن الجزيئي الملطخة</td><td>مسبقا Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>غشاء PVDF &nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>الشيخوخة & -Galactosidase تلطيخ كيت</td><td>خلية إشارات</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion / Life</td><td>Tech 10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

وردا على الإجهاد الخلوي أو ضرر، ويمكن الخلايا المتكاثرة لحث على برنامج معين الذي يبدأ حالة اعتقال دورة الخلية على المدى الطويل، ووصف الشيخوخة الخلوية. تراكم خلايا هرمة يحدث مع الشيخوخة عضوي ومن خلال زراعة المستمرة في المختبر. خلايا هرمة تؤثر العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، وإصلاح الأنسجة وتجديدها، وقمع الورم، والشيخوخة. وتشمل السمات المميزة للخلايا هرمة، ولكن لا تقتصر على، وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال)؛ INK4A P16، البروتين p53، وP21 المستويات؛ مستويات أعلى من الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX. تشكيل المرتبطة الشيخوخة-المغاير البؤر (SAHF)؛ والاستحواذ على المصاحب الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP)، وهي ظاهرة تتميز إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات والجزيئات الإشارة. هنا، نحن تصف بروتوكولات لكلا تنسخي والشيخوخة DNA الأضرار التي يسببها في الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، نسلط الضوء تقنيات لمراقبة النمط الظاهري الشيخوخي باستخدام العديد من علامات الشيخوخة المرتبطة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX وSAHF تلطيخ، ولقياس البروتين ومرنا مستويات المنظمين دورة الخلية والعوامل SASP. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتقييم الشيخوخة في مختلف النماذج والأنسجة.

<html> أرقام 2-6 تظهر نتائج ممثلة من تلطيخ SA-β-غال. تلطيخ لγ-H2AX وSAHF. تقييم مستويات البروتين من INK4A P16، P21، والبروتين p53. ومرنا ومستويات البروتين من جزيئات هرمة المصاحب. تحدث زيادة تلطيخ SA-β-غال مع تنسخي والحمض النووي الناجم عن الضرر الشيخوخة. أيضا، لاحظ التغيرات المورفولوجية التي تحدث مع الشيخوخة. تصبح الخلايا الموسع ومسطحة بالمقارنة مع ظهور المغزل من الخلايا الليفية المتكاثرة. لهذا النموذج التجريبي، وكانت ملطخ...

الشيخوخة الخلوية، والدولة لا رجعة فيها اعتقال دورة الخلية، يمكن الناجمة عن مختلف الضغوط الخلوية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للحث على الشيخوخة وطرق الخلوية لتقييم علامات الشيخوخة.

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

الهدف العام لهذه التقنيات هو توفير صندوق أدوات لتمكين تحريض الشيخوخة الخلوية ومراقبتها وقياسها. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تحديد وقياس الشيخوخة الخلوية والعوامل البيولوجية التي تنظم الشيخوخة الخلوية والكائنات الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تشمل مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة الشيخوخة الخلوية في نماذج وأنسجة وأنواع خلايا مختلفة.ابدأ بطلاء الخلايا التكاثرية الممر المبكر ذات الأهمية بكثافة متناثرة في الطبق المناسب للتحليل. وزرع الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة. عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 50-60٪ ، قم بشفط وسط النمو واغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين.بعد الغسيل الثاني ، قم بتغطية الخلايا بطبقة رقيقة من PBS. وتعريض الخلايا لجرعة واحدة من 10 درجات من تشعيع جاما. استبدل PBS بوسط النمو.وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. تغيير الوسط كل 48 إلى 72 ساعة مع المراقبة اليومية للتغيرات المورفولوجية تحت المجهر الضوئي. بعد سبعة إلى 10 أيام من التشعيع ، قم بإذابة جميع الكواشف من مجموعة فحص بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة التجارية في حمام مائي 37 درجة مئوية.عندما تصل جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد محاليل التثبيت والتلوين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وغسل كل بئر برفق باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة. احرص على شطف الخلايا بعناية لأن خلايا الشيخوخة لا تلتصق جيدا ويمكن إزالتها بسهولة أثناء الغسيل.ثبت الخلايا في كل بئر بملليلتر واحد من محلول التثبيت لكل بئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. متبوعا بغسلتين ملليلترتين مع PBS لكل بئر. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز إلى كل بئر وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لمدة 24 إلى 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.افحص الزنازين في 24 ساعة. عندما تكون الخلايا ملطخة بدرجة كافية ، استبدل محلول بيتا غال ب PBS جديد وافحص الثقافات على مجهر ضوئي بكاميرا متصلة بزاوية 10x أو هدف أعلى. ستظهر خلايا بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة باللون الأزرق.بعد ذلك ، احصل على ما لا يقل عن خمس صور غير متداخلة لكل بئر. وقم يدويا بحساب العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية للشيخوخة المرتبطة ببيتا جالاكتوزيداز والعدد الإجمالي للخلايا لكل صورة لحساب النسبة المئوية لخلايا بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة لكل بئر. بعد 10 أيام من تشعيع جاما ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.بعد الغسيل الأخير ، استبدل PBS ب 2.5 مل من الوسط الخالي من المصل ، مع استكمال المضادات الحيوية لكل طبق يبلغ طوله ستة سنتيمترات وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، انقل الوسط إلى أنبوب مخروطي على الجليد. واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الطازج.ثم ، قم بعمل التربسين وعد الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للطاف الذي يتم حصاده من لوحة زراعة الخلية. ثم قم بتصفيته من خلال مصفاة حقنة 0.45 ميكرومتر وتجميد الوسط في 500 ميكرولتر عند 80 درجة مئوية حتى تحليلها بواسطة ELISA.يحدث تلطيخ بيتا غال المرتبط بالشيخوخة مع الشيخوخة التكاثرية وتلف الحمض النووي. لاحظ الشكل المسطح المتضخم للخلايا الشائخة مقارنة بالمظهر الشبيه بالمغزل للأرومات الليفية المتكاثرة. في هذه التجربة ، تم إصلاح الخلايا الشابة الشابة أو التكاثرية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.وملطخة بجسم مضاد ضد علامة حيوية لفواصل الحمض النووي المزدوجة و DAPI. مع زيادة واضحة في عدد الحمض النووي مزدوج الكسر لوحظ في الخلايا القديمة. يكشف تحليل RT-qPCR لعوامل النمط الظاهري الإفرازي المرتبطة بالشيخوخة أن بعض العوامل على الأقل يتم تنظيمها بعد تشعيع جاما الناجم عن الشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية ثنائية الصبغيات منخفضة الممر على مستوى الحمض النووي المترني.وهو ما تؤكده ELISA أيضا للطافات الطفية لزراعة الخلايا المشعة بجاما. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تحريض تلف الحمض النووي وتلوين SA beta-gal في حوالي 30 دقيقة من التدريب العملي. يمكن تحضير وسائط الحالة لقياس مستويات بروتين SASP في حوالي 30 دقيقة.أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبتها وهي تخضع لتغيرات مورفولوجية في مزارع الخلايا قبل الشروع في القياس الكمي لعلامة الشيخوخة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجالات الشيخوخة والسرطان لاستكشاف الشيخوخة في مجموعة متنوعة من الأنسجة ومزارع الخلايا والكائنات الحية النموذجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز الشيخوخة الخلوية ومراقبتها وقياسها.

techniques-to-induce-and-quantify-cellular-senescence

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

سواء الشيخوخة يمنع تكون الأورام أو يروج تبقى مثيرة للجدل. منذ المخدرات chemotherapeutical يمكن أن تحفز الخلايا السرطانية إلى senesce، ودراسة الشيخوخة أمر ضروري لاقتراح علاجات جديدة. ومع ذلك، فإن معيار وتستخدم على نطاق واسع فحص β-غالاكتوزيداز يعرض العوائق الرئيسية. نقترح هنا تدفق فحص السريع وحساسة القائم على الخلوي لتحديد الشيخوخة.

طريقة حساسة لقياس خلايا السرطان هرمة

هنا نقدم بروتوكول مفصلاً للكشف عن كل مسن والخلايا الجذعية pluripotent في العضلات الهيكلية عند الإصابة أثناء حمل في فيفو إعادة برمجة. هذا الأسلوب مناسبة لتقييم دور الشيخوخة الخلوية أثناء تجديد الأنسجة وإعادة برمجة في فيفو.

تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

وهنا، نحن نناقش سلسلة من البروتوكولات لتحريض والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا المستزرعة. نركز على مختلف المحفزات الذي يحفز الشيخوخة ووصف التحديد الكمي للعلامات الشائعة المرتبطة بالشيخوخة. نحن نقدم التفاصيل التقنية باستخدام الخلايا الليفية كنموذج، ولكن البروتوكولات يمكن أن تتكيف مع مختلف النماذج الخلوية.

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

لقد ثبت روس داخل الخلايا تلعب دوراً هاما في تنظيم دورات تعريفية للشيخوخة الخلوية. هنا، يمكننا وصف مقايسة حساسة لقياس مستويات روس أثناء الشيخوخة الخلوية. نحن نقدم أيضا بروتوكولات لتقييم المرتبطة بالشيخوخة الافرازية النمط الظاهري، الذي يقال أن تساهم مختلف الاختلالات المرتبطة بالسن.

قياس كمي للأنواع الأكسجين التفاعلية والنمط الظاهري الافرازية المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية العادية أثناء الشيخوخة التي يسببها السرطاني

الحساسية الخلوية هي العامل الرئيسي في تطوير الأمراض المزمنة المرتبطة بالعمر. تحديد العلاجات التي تستهدف الخلايا المعمرة تظهر الوعد لتمديد الشيخوخة الصحية. هنا، نقدم اختبار جديد لفحص لتحديد senotherapeutics على أساس قياس الحساسية المرتبطة بيتا-Galactosidase النشاط في خلايا واحدة.

SA-β-Galactosidase القائم على فحص الفحص لتحديد الأدوية Senotherapeutic

يصف هذا البروتوكول سير العمل لوضع العلامات الأيضية للخلايا الشائخة وغير المنقسمة باستخدام SILAC النبضي ، وتحليل مطياف الكتلة غير المستهدف ، وحساب مبسط لعمر نصف البروتين .

قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي

نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.

التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج

يتم تقديم بروتوكول للقياس الكمي الفلوري والتدفق الخلوي للخلايا السرطانية الهرمة التي تسببها أدوية العلاج الكيميائي في زراعة الخلايا أو في نماذج أورام الفئران. تشمل الإجراءات الاختيارية التلطيخ المناعي المشترك ، وتثبيت العينات لتسهيل تحليل الدفعة الكبيرة أو النقطة الزمنية ، وإثراء الخلايا الهرمة القابلة للحياة عن طريق الفرز الخلوي للتدفق.

مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

يتيح التألق المناعي متعدد الإرسال تصنيفا متسلسلا لعلامات الأجسام المضادة المتعددة ضمن قسم نسيج واحد لدعم التحليل المكاني لبنية الأنسجة ومجموعات الخلايا. هنا، يتم تقديم سير عمل للكشف عن العلامات المرتبطة بالشيخوخة والبنيوية والمناعية في التعدد، بما في ذلك إعداد الشرائح يدويا وآليا، والتصوير التكراري، وتحليل الخلايا الأحادية باستخدام برامج علم الأمراض الرقمي.

اختبار الفلورة المناعية متعددة القنوات لتقييم مكاني لعلامات الشيخوخة في الجسم الحي

تقدم هذه المقالة بروتوكول ليزوتراكر للخلايا الحية لقياس إعادة تشكيل الليسوسوم أثناء الشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية IMR-90.

التحليل الليزوزومي باستخدام LysoTracker للتقييم الكمي لشيخوخة الخلايا في الخلايا الليفية البشرية

تدرس هذه الطريقة كيف تؤثر الخلايا الليفية الجلدية المتقدمة في السن على الأصحاء. يتم تحفيز الشيخوخة من خلال التعرض للأشعة فوق البنفسجية، ويطبق الوسط المعالج على الخلايا الليفية الطبيعية. يساعد في تقييم المركبات النشطة الحيوية التي تستهدف تغير التواصل بين الخلايا في شيخوخة الجلد.

تركيبة جديدة من مضادات الأكسدة لاستعادة التواصل الصحي بين الخلايا في نموذج مختبر باستخدام وسط مشروط من خلايا متقدمة في العمر

تعلم تقنيات استحثاث الشيخوخة الخلوية وتقييم علاماتها باستخدام الخلايا الليفية البشرية. توفر هذه البروتوكولات أدوات شاملة لمراقبة الشيخوخة في نماذج مختلفة.

تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

استكشف المزيد من الفيديوهات