تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

الهدف العام لهذه التقنيات هو توفير صندوق أدوات لتمكين تحريض الشيخوخة الخلوية ومراقبتها وقياسها. يمكن أن تساعد هذه الطرق في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول تحديد وقياس الشيخوخة الخلوية والعوامل البيولوجية التي تنظم الشيخوخة الخلوية والكائنات الحية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تشمل مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة الشيخوخة الخلوية في نماذج وأنسجة وأنواع خلايا مختلفة.

ابدأ بطلاء الخلايا التكاثرية الممر المبكر ذات الأهمية بكثافة متناثرة في الطبق المناسب للتحليل. وزرع الخلايا بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة. عندما تكون الخلايا ملتصقة بنسبة 50-60٪ ، قم بشفط وسط النمو واغسل الخلايا باستخدام PBS مرتين.

بعد الغسيل الثاني ، قم بتغطية الخلايا بطبقة رقيقة من PBS. وتعريض الخلايا لجرعة واحدة من 10 درجات من تشعيع جاما. استبدل PBS بوسط النمو.

وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. تغيير الوسط كل 48 إلى 72 ساعة مع المراقبة اليومية للتغيرات المورفولوجية تحت المجهر الضوئي. بعد سبعة إلى 10 أيام من التشعيع ، قم بإذابة جميع الكواشف من مجموعة فحص بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة التجارية في حمام مائي 37 درجة مئوية.

عندما تصل جميع الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد محاليل التثبيت والتلوين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وغسل كل بئر برفق باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة. احرص على شطف الخلايا بعناية لأن خلايا الشيخوخة لا تلتصق جيدا ويمكن إزالتها بسهولة أثناء الغسيل.

ثبت الخلايا في كل بئر بملليلتر واحد من محلول التثبيت لكل بئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. متبوعا بغسلتين ملليلترتين مع PBS لكل بئر. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول تلطيخ بيتا جالاكتوزيداز إلى كل بئر وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم لمدة 24 إلى 48 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون.

افحص الزنازين في 24 ساعة. عندما تكون الخلايا ملطخة بدرجة كافية ، استبدل محلول بيتا غال ب PBS جديد وافحص الثقافات على مجهر ضوئي بكاميرا متصلة بزاوية 10x أو هدف أعلى. ستظهر خلايا بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة باللون الأزرق.

بعد ذلك ، احصل على ما لا يقل عن خمس صور غير متداخلة لكل بئر. وقم يدويا بحساب العدد الإجمالي للخلايا الإيجابية للشيخوخة المرتبطة ببيتا جالاكتوزيداز والعدد الإجمالي للخلايا لكل صورة لحساب النسبة المئوية لخلايا بيتا جالاكتوزيداز المرتبطة بالشيخوخة لكل بئر. بعد 10 أيام من تشعيع جاما ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS.

بعد الغسيل الأخير ، استبدل PBS ب 2.5 مل من الوسط الخالي من المصل ، مع استكمال المضادات الحيوية لكل طبق يبلغ طوله ستة سنتيمترات وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة طوال الليل. في صباح اليوم التالي ، انقل الوسط إلى أنبوب مخروطي على الجليد. واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الطازج.

ثم ، قم بعمل التربسين وعد الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للطاف الذي يتم حصاده من لوحة زراعة الخلية. ثم قم بتصفيته من خلال مصفاة حقنة 0.45 ميكرومتر وتجميد الوسط في 500 ميكرولتر عند 80 درجة مئوية حتى تحليلها بواسطة ELISA.

يحدث تلطيخ بيتا غال المرتبط بالشيخوخة مع الشيخوخة التكاثرية وتلف الحمض النووي. لاحظ الشكل المسطح المتضخم للخلايا الشائخة مقارنة بالمظهر الشبيه بالمغزل للأرومات الليفية المتكاثرة. في هذه التجربة ، تم إصلاح الخلايا الشابة الشابة أو التكاثرية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

وملطخة بجسم مضاد ضد علامة حيوية لفواصل الحمض النووي المزدوجة و DAPI. مع زيادة واضحة في عدد الحمض النووي مزدوج الكسر لوحظ في الخلايا القديمة. يكشف تحليل RT-qPCR لعوامل النمط الظاهري الإفرازي المرتبطة بالشيخوخة أن بعض العوامل على الأقل يتم تنظيمها بعد تشعيع جاما الناجم عن الشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية ثنائية الصبغيات منخفضة الممر على مستوى الحمض النووي المترني.

وهو ما تؤكده ELISA أيضا للطافات الطفية لزراعة الخلايا المشعة بجاما. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تحريض تلف الحمض النووي وتلوين SA beta-gal في حوالي 30 دقيقة من التدريب العملي. يمكن تحضير وسائط الحالة لقياس مستويات بروتين SASP في حوالي 30 دقيقة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبتها وهي تخضع لتغيرات مورفولوجية في مزارع الخلايا قبل الشروع في القياس الكمي لعلامة الشيخوخة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنيات الطريق للباحثين في مجالات الشيخوخة والسرطان لاستكشاف الشيخوخة في مجموعة متنوعة من الأنسجة ومزارع الخلايا والكائنات الحية النموذجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز الشيخوخة الخلوية ومراقبتها وقياسها.