بروتوكولات للتحقيق في توزيع الأنسجة المضيف، نقل واسطة، وتأثير ذلك على الرشاقة المضيف من Densovirus في دودة اللوز القطن

الهدف العام من هذا البروتوكول هو دراسة تأثير فيروس Densovirus ، HaDV2 ، على مضيفه ، دودة اللوز القطنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعل مضيف الفيروسات مثل تأثير الفيروسات التي تقف الآن على مضيفيها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية التي تستخدمها اليرقات لبناء سلالات إيجابية وسالبة للفيروس مشتقة من نفس المضيفين المشتركين ، مما يضمن نفس الخلفية الجينية.

لبدء التجربة ، تزاوج ثمانية زوج واحد من العث المغلقة حديثا باستخدام قفص بلاستيكي لكل زوج مغطى بشاش قطني لضمان تهوية جيدة وليكون بمثابة ركيزة لموضع البويضة. لزيادة احتمالية الحصول على مستعمرة خالية من الفيروسات ، استخدم ما لا يقل عن 30 زوجا من التزاوج أحادي الزوج. قم بإطعام العث البالغ بكرة قطنية مبللة بمحلول سكر 10٪ و 2٪ من فيتامين ، وقم بتجديد المحلول يوميا.

الشاش بعد التزاوج اليوم ، حيث تضع الإناث البالغات بيضهن على شاش قطني ، في تغيير الشاش يوميا. اجمع البيض المحتوي على الشاش وحافظ عليه في نفس غرفة النمو مثل العث البالغ حتى يفقس البيض. انقل اليرقات حديثة الفقس على الفور إلى ألواح جديدة مكونة من 24 بئرا مع فرد واحد لكل بئر.

بعد خمسة أيام من تاريخ وضع البيض الأول ، اجمع العث الأم وقم بتخزينها في النيتروجين السائل. تحقق من وجود HaDV2 للوالدين الذين يستخدمون تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بادئات محددة ، واحتفظ بالأفراد الخاليين من HaDV2 كسلالة غير مصابة خالية من HaDV2. اجمع العث البالغ بشكل فردي وقم بتخزينها على الفور في النيتروجين السائل.

طحن العث الفردي الذي تم جمعه بالكامل في النيتروجين السائل باستخدام ملاط ومدقة معقمة. انقل حوالي 10 ميكروغرامات من الحطام إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 مل. ثم انقل الحطام المتبقي إلى أنبوب جديد ثم قم بتخزينه على الفور عند 80 درجة مئوية.

استخرج الحمض النووي من 10 ميكروغرام من الحطام باتباع البروتوكولات التي توفرها الشركة المصنعة. بمجرد عزل الحمض النووي للعثة ، تحقق من HaDV2 باستخدام البروتوكول. وفقا للنتائج ، قسم الحطام المتبقي إلى مجموعتين: HaDV2 إيجابي و HaDV2 سالب.

أضف ملليلترا واحدا من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات ، أو PBS ، إلى كل فرد لإذابة بقايا اليرقات المتبقية تماما. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي مسبقا بأربع درجات مئوية ، ثم قم بتدوير المتجانس. على الجليد ، قم بتصفية المادة الطافية السائلة باستخدام مرشح غشاء 0.22 ميكرون.

اجمع 200 ميكرولتر لكل أنبوب من السوائل المفلترة ، وقم بتخزينها على الفور عند 80 درجة مئوية. لتحديد كفاءة العدوى الفموية بالسوائل المفلترة المصابة ب HaDV2 بتركيزات مختلفة عن طريق تخفيف السائل المحتوي على HaDV2. في غطاء الدخان ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من HaDV2 بالتساوي ، والتي تحتوي على سوائل مصفاة لكل تركيز على سطح النظام الغذائي الاصطناعي الصلب.

بعد ذلك ، ابدأ في نقل 100 يرقة حديثة الفقس إلى HaDV2 التي تحتوي على نظام غذائي اصطناعي في طبق بتري. اطرق الشاش القطني برفق بما في ذلك اليرقات الحديثة الفقس لنقل اليرقات من الشاش إلى ورقة بيضاء. اطرق الورق برفق حتى تدور اليرقات الحرير وتبلل من الورق.

استخدم ملقطا معقما للمس الحرير ونقل اليرقات إلى طبق بتري. بعد 48 ساعة ، انقل يرقة واحدة لكل بئر في النظام الغذائي الاصطناعي إلى 24 طبقا من 24 بئرا. أعد تربية اليرقات الملقحة ب HaDV2 ، باستخدام نفس التركيزات في مرحلة البالغين.

تحقق من حالة عدوى HaDV2 للبالغين باستخدام البروتوكول. أنتج البالغون الذين تم تطعيمهم برقم نسخة من 10 إلى ثامن لكل ميكرولتر من HaDV2 عدوى بنسبة 100٪ ويتم الاحتفاظ بهم كسلالة إيجابية ل HaDV2. لمنع التلوث ، قم بتعقيم الملقط والمقص في 75٪ من الإيثانول ثلاث مرات ثم قم بتسخينهما في لهب مصباح الكحول.

باستخدام ميزان تحليلي ، قم بوزن الأنابيب الفارغة التي سيتم استخدامها لتخزين الأنسجة. بعد ذلك ، ضع اليرقات والعث البالغ من السلالة المصابة على الجليد لمدة خمس دقائق تقريبا. قم بإصلاح اليرقات المجمدة على المنثانة باستخدام دبابيس حشرية يتم إدخالهما في الأغشية المتقاطعة بالقرب من الرأس والجزء الأخير من البطن.

ثم في البطن الخلفي ، قم بقطع مقدمة اليرقات بحيث يتدفق الهيموليف. استخدم ماصة لماصة حوالي 10 ميكرولترات من الهيموليمف اليرقات في غضون 10 ثوان تقريبا لمنع تحولها إلى اللون البني وتخثر الهيموليمف. باستخدام زوج من المقص ، قم بعمل شق في بشرة يتراوح من آخر غشاء بين القطاعات إلى الرأس.

باستخدام ملقطين ، قم بتشريح الأمعاء الأمامية ، والأمعاء الوسطى ، والأمعاء الخلفية ، والجسم الدهني ، والأنابيب المالبيجين. لمنع تلوث الأنسجة المتبقية بالهيموليمف أثناء التشريح ، اغسل الأنسجة المقطوعة في محلول PBS. امزج عينات الأنسجة من ثلاثة أفراد معا كنسخة مكررة واحدة.

انقل كل نسيج على الفور إلى الأنابيب في النيتروجين السائل. في طبق بتري نظيف يحتوي على مخزن مؤقت PBS ، قم بتشريح أنسجة الإناث والذكور البالغين وانقل كل نسيج على الفور إلى الأنابيب في النيتروجين السائل. قم بوزن الأنابيب والأنسجة المذكورة أعلاه معا بشكل منفصل واحسب كتلة الأنسجة.

استخرج الحمض النووي من هذه الأنسجة وقم بإجراء kPCR لتحديد العيار الفيروسي لكل نسيج. ضع ما لا يقل عن 100 شرانق أو عثة بالغة ظهرت حديثا مشتقة من السلالة غير المصابة في قفص شبكي سلكي مغطى بشاش قطني سعة 5 لترات. بعد يومين ، ستبدأ الإناث البالغات المتزاوجة في وضع البيض على شاش القطن.

اجمع وحافظ على شاش القطن الذي يحتوي على البيض. المضي قدما في تلقيح يرقات حديثي الولادة عن طريق نقل يرقات حديثي الولادة من السلالة غير المصابة إلى النظام الغذائي الاصطناعي الذي يحتوي على HaDV2 لتأسيس السلالة المصابة. وبالمثل ، قم بنقل يرقات حديثي الولادة إلى نظام غذائي اصطناعي مغطى بسائل مفلتر خال من HaDV2 لإنشاء مجموعات التحكم ، السلالة غير المصابة.

قم بتضمين ما لا يقل عن 240 يرقة في كل علاج. بعد 48 ساعة ، انقل يرقة واحدة لكل بئر إلى أطباق 24 بئرا. قم بترقيم كل يرقة في كل بئر بالتتابع ، وسجل مرحلة الطور وحالة البقاء على قيد الحياة يوميا.

بعد حوالي خمسة أيام ، عندما يتدهور النظام الغذائي الاصطناعي ، انقل هؤلاء الأفراد في نفس الوقت إلى طبق جديد مكون من 24 بئرا يحتوي على نظام غذائي اصطناعي طازج. قم بوزن اليرقات من اليوم السابع إلى الحادي عشر باستخدام ميزان تحليلي. بعد الوزن ، أعد اليرقات بشكل فردي إلى اللوحة المكونة من 24 بئرا.

عند طرح الريش إلى الطور الخامس ، بعد حوالي عشرة أيام من الفقس ، انقل اليرقات إلى أنابيب زجاجية. انقل الأفراد إلى الأنبوب الزجاجي في نفس الوقت كل يوم. يمكن أيضا التعرف على يرقات الطور الخامس من خلال عرض كبسولة الرأس.

بعد ذلك ، قم بترميز كل يرقة برقمها المرجعي الأصلي على الأنبوب الزجاجي باستخدام الطلاء أو العلامات. سجل حالة اليرقات يوميا. سجل الشرانق وتاريخ الإغلاق لكل فرد في الأنبوب الزجاجي ، وسجل كتلة الشرانق البالغة من العمر ثلاثة أيام.

بعد الإغلاق ، ضع أنثى وذكرا في قفص واحد مع محلول 10٪ سكروز و 2٪ فيتامين. جدد محلول السكروز كل يوم. سجل تاريخ الوفاة لكل عثة.

عندما يتم وضع البيض ، قم بتغيير الشاش القطني يوميا. احسب عدد البيض على الفور. أخيرا ، عد النسل حديث الفقس أثناء فقسها.

تم تشغيل Tri-als لضمان جودة العينات المستخدمة في التجربة. تم تربية ذرية الآباء من الذكور والإناث الذين خالنا من HaDV2 على أنهم سلالة غير مصابة. نجحنا في تضخيم جين الأكتين في الآباء والنسل باستخدام نفس قالب الحمض النووي مما يشير إلى أن قوالب الحمض النووي كانت ذات نوعية جيدة.

النسل الثمانية المختارة عشوائيا خالية أيضا من HaDV2 و HaNPV و Wolbachia. يظهر المنحنى القياسي الذي يحدد العلاقة بين سجل جودة المواد الأولية وقيم التصوير المقطعي المحوسب المكتسبة ارتباطا خطيا قويا بين قيم التصوير المقطعي المحوسب وسجل رقم نسخة الجينات الأولية ل HaDV2. تم حساب رقم نسخة HaDV2 لكل ميكروغرام من كل نسيج ، وكشفت النسبة المئوية لإجمالي عيار HaDV2 للأنسجة المحددة أن HaDV2 تم توزيعه بشكل أساسي في الجسم الدهني.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع اليرقات الحساسة خلال الأيام الخمسة الأولى بعد فقسها أثناء إجراء الإطارات.