تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم آثار العدوى البكتيرية على قدرة الخلايا المضيفة على تكوين حبيبات الإجهاد للاستجابة للإجهاد الخارجي. هذه الطريقة هي أداة قيمة في مجال علم الأحياء الدقيقة الخلوية لتقييم ما إذا كان مسببات الأمراض قادرة على تغيير أو تخريب مسار حبيبات الإجهاد بأكمله أم لا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل حبيبات الإجهاد نوعيا وكميا بطريقة صارمة وآلية باستخدام برامج تحليل الصور المجانية.

توفر هذه الطرق نظرة ثاقبة لديناميكيات تكوين حبيبات الإجهاد وتكوينها وكيف تتأثر هذه المعلمات بممرض معين. شكرا. قبل البدء في التحدي ، قم بتلقيح مستعمرة بكتيريا S.flexneri M90T الحمراء من صفيحة أجار الصويا التريبتيك 1٪ الكونغو الأحمر في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر ، يحتوي على ثمانية ملليلتر من مرق الصويا التريبتي.

بعد شد الغطاء ، احتضن المستعمرة طوال الليل مع الرج عند 222 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. في اليوم التالي ، استزراع 150 ميكرولترا من البكتيريا في ثمانية ملليلتر من مرق الصويا الطازج لمدة ساعتين تقريبا عند 37 درجة مئوية و 222 دورة في الدقيقة لبدء تحريض المرحلة الأسية المتأخرة للتعبير الجيني للضراوة وتعزيز قابلية العدوى البكتيرية. عندما تكون الكثافة البصرية للثقافة الفرعية بين 0.6 و 0.9 ، قم بنقل مليلتر واحد من البكتيريا إلى أنبوب سعة 1.5 مليلتر لتجميعها عن طريق الطرد المركزي.

وأعد تعليق الحبيبات في وسط العدوى بكثافة بصرية واحدة. بعد ذلك ، استنشق المواد الطافية من كل بئر من ثقافة غطاء خلية HeLa. وغسل خلايا HeLa بعناية ب 500 ميكرولتر من وسط خلية HeLa الطازجة بدرجة حرارة الغرفة لكل بئر.

استبدل الغسيل ب 500 ميكرولتر من وسط العدوى لكل بئر ، وقم بالطرد المركزي للوحة 24 البئر لتدوير البكتيريا على الخلايا. انقل المزارع البكتيرية المستقرة إلى حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسهيل إصابة الخلية المضيفة. في نهاية الحضانة ، قم بإزالة البكتيريا الخارجية من الخلايا بثلاث شطف في مليلتر واحد من وسط ثقافة هيلا الطازج 37 درجة مئوية لكل غسلة.

ثم قم بتغطية الخلايا المصابة بملليلتر واحد من وسط الزراعة الطازج الذي يحتوي على الجنتاميسين وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا. في نهاية الحضانة ، استبدل الوسط ب 500 ميكرولتر من وسط الثقافة المناسب ، مع استكمال الضغوطات ذات الأهمية ، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة. بعد ساعة واحدة ، قم بشفط المادة الطافية تماما ، وقم بإصلاح العينات في 0.5 مل من درجة حرارة الغرفة 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، تخلص من المثبت في حاوية النفايات المناسبة ، واغسل الغطاء بمليلتر واحد من محلول ملحي مخزن ثلاثي لمدة دقيقتين مع رج لطيف. في نهاية الغسيل ، قم بشفط TBS بالكامل وقم باختراق الخلايا في كل بئر ب 500 ميكرولتر من 0.3٪ Triton X-100 في TBS. بعد 10 دقائق ، استبدل محلول النفاذية بمليلتر واحد من TBS ، وقم بتدوير اللوحة برفق ، واستبدل TBS بمليلتر واحد من محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

لتسمية الخلايا بمزيج أساسي من الأجسام المضادة ذات الأهمية ، ضع 50 ميكرولترا من مزيج الأجسام المضادة الأولية لكل غطاء على قطعة من البلاستيك Parafilm مثبتة بإحكام على سطح المقعد. ثم استخدم الملقط لالتقاط الغطاء الأول. وامسحت حافة الغطاء على قطعة من المناديل الورقية لإزالة السائل الزائد.

ضع الغطاء بحذر على القطرة واحتضن الغطاء تحت ظروف الملصقات المناسبة. في نهاية حضانة وضع العلامات الأولية على الأجسام المضادة ، انقل كل غطاء إلى بئر فردي من صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على مليلتر واحد من TBS لكل بئر ، واغسل الخلايا في درجة حرارة الغرفة على شاكر لوحة لمدة خمس دقائق ثلاث مرات. بعد الغسيل الأخير ، قم بتسمية الخلايا الموجودة على كل غطاء بمزيج كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية المناسب ، كما هو موضح للتو.

واحتضان الأغطية في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية حضانة وضع العلامات على الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من PBS ثلاث مرات في صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا مع اهتزاز لطيف كما هو موضح للتو ، ولكن محمية من الضوء. بعد الغسيل الأخير ، اغمس كل غطاء لفترة وجيزة في الماء منزوع الأيونات لإزالة الملح ، وامسح حواف الغطاء على منديل ورقي ، وقم بتركيب الغطاء بعناية على خمسة ميكرولترات من وسط تركيب التألق لكل شريحة مجهر زجاجي بدون فقاعات.

ثم ختم الغطاء بطلاء الأظافر. وقم بتخزين الشرائح حسب الاقتضاء حتى التصوير. لتصوير الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر الفلوري ، ابدأ بتحديد الهدف المناسب وقنوات الفلورسنت المناسبة للحصول على الصور.

ثم احصل على مجموعات صور للخلايا باستخدام برنامج التصوير المناسب. عند التقاط جميع الصور، استخدم برنامج تحليل التصوير المناسب لطي مكدسات الصور وحفظ المكدسات كملفات TIFF. بعد ذلك، قم بتحميل عنصر تحكم وصورة TIFF تجريبية إلى النظام الأساسي لتحليل الصور، وحدد جدول البحث لفتح معلمات القناة في نافذة التسلسل.

انقر فوق جميع مربعات اختيار علامة تبويب القناة لإلغاء تنشيط جميع القنوات. ثم انقر فوق القناة صفر ، وانقر فوق شريط ألوان القناة الصفرية لتحديد اللون المفضل ، مما يزيد من شدة القناة حسب الضرورة لتصور جميع الهياكل. بعد تحديد وضبط كل قناة من قنوات الألوان المناسبة للتحليل التجريبي ، حدد علامة التبويب لوحة وضبط علامة التبويب التكبير/التصغير لتصور حوالي 10 خلايا لكل حقل عرض.

باستخدام أداة المضلع ، انقر فوق الخلية محل الاهتمام وقم بتمديد الخط حول الخلية لتحديد حدود الخلية. لتسمية منطقة الاهتمام هذه، في نافذة منطقة الاهتمام، انقر بزر الماوس الأيمن فوق خلية الاهتمام، وانقر نقرا مزدوجا فوق اسم منطقة الاهتمام لتعديلها. بعد تحديد جميع الخلايا ذات الأهمية وتسميتها بنفس الطريقة ، افتح تطبيق Spot Detector ضمن علامة التبويب الكشف والتتبع.

افتح علامة التبويب المعالجة المسبقة وحدد القناة المراد تحليلها. ضمن علامة التبويب كاشف ، حدد اكتشاف النقاط الساطعة على الخلفية الداكنة وحدد المقياس والحساسية المناسبين. ضمن علامة التبويب منطقة الاهتمام، حدد منطقة الاهتمام المقترحة من التسلسل.

ضمن علامة التبويب التصفية، حدد NoFiltering. في علامة التبويب الإخراج، حدد الإخراج المناسب. حدد إزالة النقاط السابقة المعروضة كمناطق اهتمام وانقر فوق عدم تحديد أي ملف لتحديد المجلد لحفظ الملف.

ثم ضمن علامة التبويب عرض، حدد الخيارات المناسبة ذات الاهتمام وانقر فوق بدء الاكتشاف. ضمن برنامج تحليل التصوير ، يمكن استخدام كاشف البقع لتحديد حبيبات الإجهاد داخل كل منطقة من مناطق الاهتمام المحددة. يمكن بعد ذلك إنشاء صورة ثنائية لعرض جميع حبيبات الإجهاد المحددة.

يجب تصميم تحليل حبيبات الإجهاد بعناية لكل سوق حبيبات الإجهاد يتم تحليلها. على سبيل المثال ، يؤدي تغيير متطلبات الحجم لمنطقة الاهتمام المكتشفة ، أو تغيير حساسية معلمات الكشف إلى نتائج متفاوتة. في مقاييس حجم البكسل الأعلى ، لن يتم حساب حبيبات الإجهاد الأصغر ، وستنخفض أعداد حبيبات الإجهاد.

بينما تؤدي زيادة الحساسية إلى زيادة عدد حبيبات الإجهاد. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، أعطى مقياس من اثنين بحساسية 100 أفضل نتيجة من علامة حبيبات الإجهاد G3BP1. بينما أعطى مقياس من اثنين بحساسية 55 أفضل نتيجة لعلامة حبيبات الإجهاد EIF3B.

يمكن بعد ذلك حساب مساحة السطح من حجم حبيبات الإجهاد. تعتبر مخططات توزيع التردد مفيدة لتسليط الضوء على التحولات في حجم حبيبات الإجهاد بين مجموعات الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن توفر شدة التألق معلومات حول جودة حبيبات الإجهاد التي تم تحليلها.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تحدي الخلية بالكامل في حوالي ست إلى سبع ساعات ، ويمكن إكمال التحليل في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات أخرى. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما معالجة عناصر التحكم والعينات التجريبية في نفس الوقت وتحت نفس الظروف لتقليل التباين داخل البيانات. باتباع هذا الإجراء ، يمكن أيضا توسيع التحليل إلى حجم ثلاثي الأبعاد للحصول على رؤى إضافية حول توطين حبيبات الإجهاد.

يسمح هذا الإجراء شبه الآلي بإجراء تحليل صارم وغير متحيز لحبيبات الإجهاد في الخلايا غير المصابة والمصابة. يمكن أن يكشف عن تخريب غير معروف سابقا لمسار حبيبات الإجهاد. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة الخلايا بالبكتيريا ، وكيفية تحفيز تكوين حبيبات الإجهاد ، وكيفية استخدام نهج شبه آلي لتحليل حبيبات الإجهاد بطريقة نوعية وكمية.

ولا تنس أنه مع شيجيلا فليكسنيري وحبيبات الإجهاد ، يمكن أن تكون العوامل المسببة للكلوبتريمازول خطيرة ، وأن الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ، والعمل في مختبر BL2 ، والتخلص من جميع الكواشف بشكل صحيح ضرورية.