تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

الهدف العام من هذه التجربة هو تقييم آثار العدوى البكتيرية على قدرة الخلايا المضيفة على تكوين الحبيبات الإجهادية للاستجابة للإجهاد الخارجي. وتعد هذه الطريقة أداة قيمة في مجال الميكروبيولوجيا الخلوية لتقييم ما إذا كان ممرض معين قادراً على تغيير أو تعطيل مسار الحبيبات الإجهادية بالكامل. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تحليل الحبيبات الإجهادية نوعياً وكمياً بطريقة دقيقة ومؤتمتة باستخدام برامج تحليل الصور المجانية.

توفر هذه الطرق رؤية متعمقة حول ديناميكيات تكوين الحبيبات الإجهادية وتكوينها، وكيف تتأثر هذه المعايير بممرض معين. شكراً لكم. قبل بدء التحدي، قم بتلقيح مستعمرة بكتيريا S.flexneri M90T حمراء من طبق آجار صويا تريبتيك يحتوي على 1% Congo red ومخطط حديثاً في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter، يحتوي على ثمانية milliliter من مرق صويا تريبتيك.

بعد إحكام إغلاق الغطاء، يتم تحضين المستعمرة طوال الليل مع الرج بسرعة 222 RPM ودرجة حرارة 30 درجة مئوية. وفي اليوم التالي، يتم استزراع 150 µL من البكتيريا في 8 mL من مرق صويا تريبتيك الطازج لمدة ساعتين تقريباً عند 37 درجة مئوية وسرعة 222 RPM لبدء تحريض التعبير عن جينات الضراوة في المرحلة الأسية المتأخرة ولتعزيز القدرة الإعدائية للبكتيريا. وعندما تتراوح الكثافة الضوئية للمزرعة الفرعية بين 0.6 و0.9، يتم نقل 1 mL من البكتيريا إلى أنبوب سعة 1.5 mL لجمعها عن طريق الطرد المركزي.

ثم أعد تعليق الراسب في وسط العدوى عند كثافة ضوئية مقدارها 1. بعد ذلك، اشفط السوائل الطافية من كل بئر من مستنبت الخلايا HeLa على غطاء شريحة. واغسل خلايا HeLa بعناية باستخدام 500 µL من وسط خلايا HeLa الطازج في درجة حرارة الغرفة لكل بئر.

استبدل سائل الغسيل بـ 500 µL من وسط العدوى لكل بئر، ثم قم بطرد مركزي لصفيحة الـ 24 بئراً لترسيب البكتيريا فوق الخلايا. انقل المزارع البكتيرية المشتركة المترسبة إلى حاضنة زراعة أنسجة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة لتسهيل إصابة الخلايا المضيفة. وفي نهاية فترة التحضين، قم بإزالة البكتيريا الخارجية من الخلايا عن طريق الشطف ثلاث مرات باستخدام 1 mL من وسط زراعة خلايا HeLa الطازج عند درجة حرارة 37 °C في كل غسلة.

ثم قم بتغطية الخلايا المصابة بـ 1 ml من وسط استزراع طازج يحتوي على gentamicin وأعد الطبق إلى حاضنة استزراع الخلايا. وفي نهاية فترة الحضن، استبدل الوسط بـ 500 µL من وسط الاستزراع المناسب، المضاف إليه عامل الإجهاد المطلوب، وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الأنسجة. وبعد مرور ساعة واحدة، قم بشفط السائل العلوي تماماً، وثبّت العينات في 0.5 ml من 4% paraformaldehyde في PBS بدرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك، تخلص من المثبت في حاوية النفايات المناسبة، واغسل شرائح التغطية باستخدام 1 milliliter من المحلول الملحي المنظم بالتريس (TBS) لمدة دقيقتين مع الرج الخفيف. وفي نهاية عملية الغسل، قم بسحب TBS بالكامل وقم بنفاذ الخلايا في كل بئر باستخدام 500 microliters من 0.3% Triton X-100 في TBS. وبعد مرور 10 دقائق، استبدل محلول النفاذ بـ 1 milliliter من TBS، وقم بتدوير الطبق بلطف، ثم استبدل TBS بـ 1 milliliter من محلول الحجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

لوسم الخلايا بمزيج من الأجسام المضادة الأولية المطلوبة، ضع 50 µL من خليط الأجسام المضادة الأولية لكل شريحة غطاء على قطعة من بلاستيك Parafilm مثبتة بإحكام على سطح طاولة المختبر. ثم استخدم ملقطًا لالتقاط شريحة الغطاء الأولى، وقم بمسح حافة الشريحة بقطعة من ورق المناديل لإزالة السائل الزائد.

ضع غطاء الساحة بعناية فوق القطرة، ثم قم بحضن أغطية الساحات تحت ظروف الوسم المناسبة. وفي نهاية فترة حضن الوسم بالأجسام المضادة الأولية، انقل كل غطاء ساحة إلى بئر منفرد في طبق جديد مكون من 24 بئراً يحتوي كل بئر منه على 1 mL من TBS، واغسل الخلايا في درجة حرارة الغرفة باستخدام هزاز الأطباق لمدة خمس دقائق ثلاث مرات. بعد الغسلة الأخيرة، قم بوسم الخلايا الموجودة على كل غطاء ساحة باستخدام مزيج كوكتيل الأجسام المضادة الثانوية المناسب، كما تم توضيحه للتو.

ثم تُحضن الشرائح الغطائية في الظلام لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة تحضين وسم الأجسام المضادة الثانوية، تُغسل الخلايا في 1 mL من PBS ثلاث مرات في طبق جديد مكون من 24 بئراً مع الرج اللطيف كما تم توضيحه للتو، مع مراعاة الحماية من الضوء. وبعد الغسلة الأخيرة، تُغمس كل شريحة غطائية لفترة وجيزة في ماء منزوع الأيونات لإزالة الملح، ثم تُجفف حواف الشريحة الغطائية باستخدام منديل ورقي، وتُثبت الشرائح الغطائية بعناية فوق 5 µL من وسط تثبيت الفلورة لكل شريحة مجهرية زجاجية مع التأكد من خلوها من الفقاعات.

ثم قم بإغلاق غطاء الشريحة باستخدام طلاء الأظافر، وخزن الشرائح بالشكل المناسب حتى يحين وقت التصوير. لتصوير الخلايا باستخدام المجهر البؤري الفلوري، ابدأ باختيار الشيئية المناسبة والقنوات الفلورية المناسبة لالتقاط الصور.

بعد ذلك، يتم الحصول على مجموعات صور الخلايا باستخدام برنامج التصوير المناسب. وعندما يتم التقاط جميع الصور، يتم استخدام برنامج تحليل الصور المناسب لدمج مجموعات الصور وحفظها كملفات TIFF. بعد ذلك، قم بتحميل صورة TIFF ضابطة وصورة TIFF تجريبية إلى منصة تحليل الصور، واختر Lookup Table لفتح معلمات القناة في نافذة Sequence.

انقر فوق جميع مربعات اختيار تبويب القنوات لإلغاء تنشيط كافة القنوات. ثم انقر فوق القناة صفر، وانقر فوق شريط ألوان القناة صفر لاختيار اللون المفضل، مع زيادة كثافة القناة حسب الضرورة لتصور جميع التراكيب. بعد اختيار وضبط كل قناة لونية مناسبة للتحليل التجريبي، اختر تبويب اللوحة (canvas) واضبط تبويب التكبير لتصور حوالي 10 خلايا لكل مجال رؤية.

باستخدام أداة المضلع، انقر فوق الخلية المستهدفة وقم بتمديد الخط حول الخلية لتحديد حدودها. لتسمية منطقة الاهتمام هذه، انقر بزر الماوس الأيمن فوق الخلية المستهدفة في نافذة منطقة الاهتمام، ثم انقر نقراً مزدوجاً على اسم منطقة الاهتمام لتعديله. بعد تحديد وتسمية جميع الخلايا المستهدفة بنفس الطريقة، افتح تطبيق Spot Detector ضمن علامة تبويب الكشف والتتبع.

افتح علامة تبويب المعالجة المسبقة (Pre Processing) وحدد القناة المراد تحليلها. ومن خلال علامة تبويب الكاشف (Detector)، اختر "كشف البقع المضيئة فوق خلفية مظلمة" (Detect bright spots over dark background) وحدد المقياس والحساسية المناسبين. وتحت علامة تبويب منطقة الاهتمام (Region of Interest)، اختر منطقة الاهتمام المقترحة من التسلسل.

من علامة تبويب التصفية (Filtering)، اختر NoFiltering. وفي علامة تبويب المخرجات (Output)، اختر المخرج المناسب. حدد خيار Remove previous spots rendered as regions of interest، ثم انقر فوق no file selected لتحديد المجلد الذي سيتم حفظ الملف فيه.

ثم من علامة تبويب العرض (Display)، اختر الخيارات المناسبة المطلوبة وانقر على بدء الكشف (Start Detection). وباستخدام برنامج تحليل الصور، يمكن استخدام كاشف البقع لتحديد حبيبات الإجهاد ضمن كل منطقة اهتمام محددة. ومن ثم يمكن إنشاء صورة ثنائية لعرض جميع حبيبات الإجهاد التي تم تحديدها.

يجب مواءمة تحليل الحبيبات الإجهادية بدقة وفقاً لكل عينة من الحبيبات الإجهادية التي يتم تحليلها. فعلى سبيل المثال، يؤدي تغيير متطلبات الحجم للمنطقة المستهدفة المكتشفة، أو تغيير حساسية معايير الكشف، إلى نتائج متفاوتة. فعند استخدام مقاييس أكبر لحجم البكسل، لن يتم إحصاء الحبيبات الإجهادية الأصغر حجماً، وبالتالي ستنخفض أعداد الحبيبات الإجهادية.

وبينما تؤدي زيادة الحساسية إلى زيادة في عدد حبيبات الإجهاد. فعلى سبيل المثال، في هذه التجربة، أعطى مقياس 2 بحساسية 100 أفضل نتيجة لعلامة حبيبات الإجهاد G3BP1. بينما أعطى مقياس 2 بحساسية 55 أفضل نتيجة لعلامة حبيبات الإجهاد EIF3B.

يمكن بعد ذلك حساب مساحة السطح من خلال حجم حبيبات الإجهاد. وتُعد مخططات توزيع التكرار مفيدة لتسليط الضوء على التحولات في حجم حبيبات الإجهاد بين المجموعات الخلوية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن توفر شدة الفلورة معلومات حول جودة حبيبات الإجهاد التي تم تحليلها.

بمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام تحدي الخلية الكاملة في غضون ست إلى سبع ساعات تقريبًا، ويمكن إكمال التحليل في ساعتين إلى ثلاث ساعات أخرى. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر معالجة العينات الضابطة والتجريبية دائمًا في الوقت نفسه وتحت الظروف ذاتها لتقليل التباين في البيانات. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن أيضًا توسيع التحليل ليشمل حجماً ثلاثي الأبعاد للحصول على رؤى إضافية حول تموضع الحبيبات الإجهادية.

يسمح هذا الإجراء شبه الآلي بإجراء تحليل دقيق وغير متحيز للحبيبات الإجهادية في الخلايا غير المصابة والمصابة. ويمكن أن يكشف عن عمليات تخريب غير معروفة مسبقاً في مسار الحبيبات الإجهادية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة الخلايا بالبكتيريا، وكيفية تحفيز تكوين الحبيبات الإجهادية، وكيفية استخدام نهج شبه آلي لتحليل الحبيبات الإجهادية بطريقة نوعية وكمية.

ولا تنسَ أن التعامل مع بكتيريا Shigella flexneri والعوامل المحفزة للحبيبات الإجهادية مثل clotrimazole يمكن أن يكون خطيرًا، وأن اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات، والعمل في مختبر من المستوى الحيوي الثاني BL2، والتخلص السليم من جميع الكواشف هو أمر ضروري.