الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

الهدف العام من هذا الإجراء هو نقل كواشف الحمض النووي الريبوزي الصغير (small RNA) بكفاءة إلى الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية التثقيب الكهربائي من الجيل التالي. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في بيولوجيا الخلايا التائية، مثل كيفية تنظيم نواتج جينية محددة لتمايز الخلايا التائية والوظيفة المناعية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها طريقة عالية الكفاءة والموثوقية لنقل sRNAs وكواشف الحمض النووي الريبوزي الصغير الاصطناعية الأخرى إلى الخلايا التائية البشرية الأولية.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول بيولوجيا خلايا Th17 البشرية، ولكن يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى، مثل الخلايا اللمفاوية الأخرى من البشر أو الفئران. في اليوم صفر، يتم طلاء أطباق زراعة الأنسجة ذات الستة آبار بمقدار 1.5 milliliters لكل بئر من antihuman CD3 و antihuman CD28 في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة ساعتين على الأقل عند 37 degrees Celsius. وبمجرد عزل وغسل الخلايا أحادية النواة من دم الحبل السري، أو CBMCs، يتم إجراء عزل للخلايا التائية CD4 الموجبة عن طريق الاختيار السلبي باستخدام طقم تجاري لعزل الخلايا التائية CD4 الموجبة البشرية.

أضف محلول العزل وأعد تعليق الخلايا أحادية النواة. انقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 5 mL، ثم أضف 100 µL من مصل الجنين البقري (FBS) و 100 µL من مزيج الأجسام المضادة لكل أنبوب، ثم حضن كل أنبوب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة على هزاز مداري لضمان الخلط جيداً. بعد فترة التحضين، أضف من 3 إلى 4 mL من محلول العزل لغسل الخلايا.

قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 ×g لمدة ثماني دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لترسيب الخلايا. اشفط الطافي بعناية. انقل الخرزات المغناطيسية إلى أنبوب جديد وأضف حجماً مساوياً من منظم العزل لغسل الخرزات.

استخدم ماصة دقيقة سعة 1 ml لخلط الخرزات جيداً، ثم ضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقة واحدة على الأقل. اسحب السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الخرزات المغناطيسية في نفس الحجم الذي تم نقله في البداية قبل عملية الغسل. أضف 500 µl من محلول العزل المنظم إلى كل أنبوب وأعد تعليق الخلايا، ثم أضف 500 µl من الخرزات المغناطيسية المغسولة مسبقاً.

يُحضن الخلايا مع الخرزات المغناطيسية لمدة 15 دقيقة على هزاز مداري في درجة حرارة الغرفة لضمان الخلط جيداً. بعد التحضين، وباستخدام ماصة دقيقة سعة 1 مل، يتم سحب الخلايا وتفريغها (pipet) جيداً لـ 10 مرات على الأقل، ثم يُضاف من 3 إلى 4 مل من محلول العزل المنظم (isolation buffer) ويوضع كل أنبوب في المغناطيس لمدة دقيقتين. تُنقل خلايا T الموجبة لـ CD4 المختارة سلبياً والموجودة في السائل الطافي بعناية إلى أنبوب جديد.

بمجرد الانتهاء من عزل الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، تُحفظ الخلايا على الثلج وتُعد باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). تُغسل الأطباق المطلية بالأجسام المضادة مرتين باستخدام PBS، ثم يُضاف 1.5 milliliters من مزيج تركيز 2X من وسط استقطاب Th17 إلى كل بئر. بعد ذلك، تُفصل الخلايا التائية البشرية الموجبة لـ CD4 بواسطة جهاز الطرد المركزي لترسيب الخلايا.

قم بشفط السائل الطافي بعناية وتخلص منه، ثم أعد تعليق الخلايا في وسط أساسي خالٍ من المصل ووزع الخلايا بحيث يكون الحجم النهائي 3 mL لكل بئر ويكون تركيز السيتوكينات المستقطبة هو 1X من التركيز النهائي، ثم ضع الأطباق في حضانة تحتوي على 5% carbon dioxide عند درجة حرارة 37 °C لمدة يومين. في اليوم الثاني، قم بطلاء أطباق زراعة الأنسجة ذات 48 بئراً بـ 250 µL لكل بئر من antihuman CD3 و antihuman CD28 في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة ساعتين على الأقل عند درجة حرارة 37 °C. لتحضير RNAs الصغيرة لعملية التعداء، قم بتوزيع 1 µL من محلول مخزون siRNA بتركيز 5 µM في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL لكل عملية تعداء.

احتفظ بجميع الأنابيب على الثلج. بعد ذلك، اغسل الأطباق المغطاة بالأجسام المضادة مرتين باستخدام PBS، ثم أضف 500 µL من وسط استقطاب Th17 بتركيز 1X إلى كل بئر. بعد تحضير أطباق الزرع وكواشف عفن التعداء، أعد تعليق الخلايا باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 mL، مع السحب والضخ بلطف لضمان انفصال جميع الخلايا عن قاع الآبار.

اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي وقم بطرد مركزي للأنابيب عند 500 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. اسحب الطافي بعناية، ثم أعد تعليق الخلايا في 1 mL على الأقل من PBS للغسل. قم بعدّ خلايا Th17 الحية باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، مع استخدام استبعاد صبغة trypan blue لتقييم الحيوية، ثم قم بترسيب الخلايا في أنبوب طرد مركزي دقيق.

قم بشفط الطافي بعناية وأعد تعليق الخلايا باستخدام محلول إعادة التعليق المرفق مع الطقم. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة. أضف 9 µL من الخلايا إلى 1 µL من الـ small RNA في كل أنبوب طرد مركزي دقيق.

قم بالماصة مرة واحدة لخلط الخلايا والحمض النووي الريبي الصغير (small RNAs) من أجل عملية عفن الخلايا (transfection)، ثم قم بتحميل الخلايا في طرف قطب الماصة الموفر. ولضمان تحقيق أفضل عملية عفن خلايا، تجنب إدخال فقاعات الهواء في طرف قطب الماصة قبل البدء. نقوم بإضافة 9.5 µL من معلق الخلايا لضمان وجود كمية كافية من الخليط لمنع تكون فقاعات في ماصة التثقيب الكهربائي (electroporation pipet).

املأ الكيوفيت الموفرة بـ 3 mL من المحلول المنظم الإلكتروليتي في درجة حرارة الغرفة. ضع الكيوفيت داخل محطة الماصة نيون، ثم ضع الماصة في موضعها داخل الكيوفيت. قم بإجراء التثقيب الكهربائي فوراً لكل مزيج بحجم 10 µL من الخلايا والحمض النووي الريبي الصغير (small RNA).

بعد اكتمال عملية التثقيب الكهربائي، أضف خليط الخلايا مباشرة إلى 500 microliters من وسط استقطاب Th17 بتركيز one X في آبار مجهزة في طبق زراعة. وأخيرًا، ضع الأطباق في حاضنة تحتوي على 5% carbon dioxide وبدرجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة يومين إضافيين. يجب العمل بدقة وبسرعة لمنع موت الخلايا.

إذا كان هناك العديد من العينات المراد إجراء التثقيب الكهربائي لها، فيمكن جمع الخلايا ونقل الجينات إليها في مجموعات. يوضح هذا المخطط الكنتوري أن الخلايا التائية التي تم استنباتها في ظروف استقطاب Th17 قد عبّرت عن مستقبل الكيموكين CCR6، وعامل النسخ ROR gamma T، واللذين لم يتم التعبير عنهما عندما تم استنبات الخلايا التائية في ظروف غير مستقطبة. كما أنتجت الخلايا التائية المستنبتة في ظروف استقطاب Th17 سيتوكين IL-17A عند إعادة التحفيز، وهو ما لم يحدث في ظروف ThN.

لا يزال تمايز خلايا Th17 يحدث بعد عملية عفن (transfection) باستخدام جزيئات RNA الصغيرة، ولكن لوحظ في بعض التجارب انخفاض في تواتر إنتاج IL-17A. وهذا يوضح أهمية وجود ضابط (control) من جزيئات RNA الصغيرة المتطابقة كيميائياً للمقارنة ضمن كل تجربة. ويتم الحفاظ على الحيوية بعد العفن باستخدام جزيئات RNA الصغيرة، وتكون عادةً أعلى من 70%. أدى عفن خلايا Th17 البشرية في اليوم الثاني باستخدام تجمع siRNA يستهدف جين PTPRC، الذي يشفر CD45، إلى خفض تعبير CD45 بشكل قوي مقارنةً بـ siRNA ضابط متطابق كيميائياً.

يشير التحول أحادي المنوال في تجمع تعبير CD45، كما يظهر هنا، إلى كفاءة ترانسفكشن تقارب 100%. وقد أدى تقليل تعبير ROR gamma T بواسطة RNAi إلى تأثير وظيفي، حيث أظهرت هذه الخلايا انخفاضاً في إنتاج IL-17A مقارنة بالخلايا التي خضعت لترانسفكشن باستخدام siRNA ضابط. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء ترانسفكشن لخلايا Th17 البشرية المستقطبة في المختبر (in vitro) باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير عبر تقنية التثقيب الكهربائي من الجيل التالي.