Name: ل في المختبر كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: تعلم تقنية التحلل السريع للتوازن لقياس ارتباط الأدوية بكازيوم آفات السل الرئوي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تقييم اختراق المضادات الحيوية في الآفات التنخرية بدون نماذج حيوانية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر جونسون آند جونسون، تحالف السل، أسترا زينيكا، ريب-X و تريوس العلاجية لتوفير بيداكيلين، با-824 (بريتمانيد)، AZD5847، راديزوليد و تيديزوليد، على التوالي. بريندان بريدو، ماثيو زيمرمان، ستيفن جوزوين، إيما ري جورادو، نانسي راول، ليان لي و دانيال وينر قدمت الدعم مع تحليل مالدي، أساليب التحليلية البيولوجية، وإعداد بديل الكالسيوم، التركيب الكيميائي، وعزل الكالسيوم الأرنب. وقد تم هذا العمل بتمويل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، وجائزة # OPP1044966 و OPP1024050 إلى V. دارتواز، المعاهد الوطنية للصحة تقاسم الأجهزة منحة S10OD018072، فضلا عن التمويل المشترك من مؤسسة بيل وميليندا غيتس و ويلكوم الثقة لمركز التميز لتحسين الرصاص لأمراض العالم النامي إلى P. وايت.

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة مع موافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام نيد (نيه)، بيثيسدا، مد. أجريت جميع الدراسات التي شملت M. السل في مختبر مع مستوى السلامة الاحتواء 3 (بسل-3). 1. أرنب العدوى نموذج ومجموعة كاسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة نيوزيلندا الأرانب البيضاء مع M. السل باستخدام نظام التعرض الهباء الأنف فقط كما هو موضح سابقا. 12 ، 13 السماح للعدوى إلى التقدم لمدة 12-16 أسابيع. يخدع الأرانب مع 35 ملغ / كغ من الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين العضل، الموت ببطء الأرانب مع 0.22 مل / كغ بينتوباربيتال الصوديوم والفينيتوين الصوديوم عن طريق الوريد والمضي قدما في نكروبسيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملاقط ومشرط، وإزالة الرئتين من الصدر كاليفورنياvity. من كل الفص الرئة، تشريح تجاويف الفردية والأورام الحبيبية نخرية كبيرة باستخدام مشرط. كشط بعناية من كاسوم من تجويف والجدران الورم الحبيبي. وزن وتسجيل وتخزين العينات في 2 مل أنابيب المسمار المغطاة في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غاما-إراديت عينات الكالسيوم المعدية في 3 ميغراد على الجليد الجاف لجعلها غير مأمونة وآمنة للاستخدام في مختبر بسل-2. </li></ol> 2. في المختبر جيل من كيسوم بديل من خلايا ثب-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثب-1 حيدات في رمي 1640 المتوسطة (2 ملي L- الجلوتامين و 10٪ مصل بقري جنيني) في T175 قوارير ثقافة الخلية (80 مل / قارورة). احتضان القوارير في 5٪ كو 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الثقافة من قارورة T175 في اثنين 50 مل أنابيب مخروطية في 150 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتعليق بيليه في 10 مل من رمي 1640 وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5 ميكرولتر من هذه الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 45 ميكرولتر من رالأزرق الأزرق. مزيج جيدا بيبتينغ. نقل 10 ميكرولتر إلى عدادة الكريات وعدد عدد من حيدات ثب-1 قابلة للحياة (غير ملوثين) باستخدام المجهر الضوئي (10X التكبير). حساب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل من الثقافة. تمييع ذلك مع وسائل الإعلام رمي إلى الكثافة النهائية من 1.25 × 10 6 خلايا / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 40 مل من الثقافة على لوحة زراعة الخلايا الكبيرة (50 × 10 6 خلايا / لوحة). إضافة 40 ميكرولتر من 100 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية (فوربول 12-myristate13 أسيتات أعدت في الإيثانول) والسماح للخلايا على الالتزام بين عشية وضحاها في الحاضنة. ملاحظة: تركيز النهائي من سلطة النقد الفلسطينية هو 100 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع حمض الأوليك النقي (أوا) (0.89 غرام / مل) في الإيثانول إلى تركيز 0.1 M ( أي 31.7 ميكرولتر الزراعة العضوية في 968.3 ميكرولتر الإيثانول). تمييع هذا الحل في وسائل الإعلام رمبي قبل تحسنت جديدة إلى تركيز 10 ملم. تمييع هذا تعليق أوا إلى 0.4 ملم (تركيز العمل النهائي) في رمي المتوسطة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الوسائط الموجودة وغيرخلايا -edhered من لوحات ثقافة الخلية وإضافة بلطف 40 مل من 0.4 مم الزراعة العضوية إلى الضامة ثب-1 (ثب-M). احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر الضوئي في التكبير 40X لتأكيد بصريا وجود العديد من الشحوم الجسم الدهون في كل ثب-M. إزالة جميع المتوسطة رمي من لوحات زراعة الخلايا وغسل بلطف الخلايا الملتصقة مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) باستخدام ماصة 50 مل المصلية. ملاحظة: تظهر الهيئات الدهنية هياكل صغيرة، واضحة، كروية في السيتوبلازم من ثب-M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 مل من 5 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) في برنامج تلفزيوني لكل لوحة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الضامة رغوي (فم) من قبل بيبتينغ مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا على سطح لوحة كاملة باستخدام ماصة 10 مل المصلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور باستمرار في 150 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من برنامج تلفزيوني (ثالث بس غسل) أونقل إلى أنابيب مخروطية قبل وزنها 15 مل. تدور باستمرار مرة أخرى في 150 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية طاف باستخدام ماصة المصلية وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع الكريات فم إلى 3 دورات تجميد ذوبان الجليد إلى ليز الخلايا واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة لتفريق البروتينات في المصفوفة. تخزين الكريات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 3. السريع موازنة غسيل الكلى (الأحمر) الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ملي حلول الأسهم من جميع مركبات الاختبار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو). تمييع إلى 500 ميكرومتر حلول العمل في دمسو قبل كل فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن أنبوب يحتوي على الكالسيوم بديل بيليه. طرح وزن أنبوب فارغ لاستخلاص وزن بيليه وحده. إضافة 2-3 الخرز المعدنية لكل أنبوب، وذلك باستخدام الخالط الأنسجة في 1،200 السكتات الدماغية / دقيقة لمدة 1 دقيقة، وتعطيل كاسوم أو المصفوفة البديلة في برنامج تلفزيوني (1: 9 ث / ت) لتحقيق 10X تعليق المخفف من كل مصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع 6.5 ميكرولتر من 500محلول ميكرومتر من مجمع الاختبار إلى 643.5 ميكرولتر من جناسة لتحقيق تركيز النهائي من 5 ميكرومتر (≤1٪ دمسو) والدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج الأحمر في لوحة قاعدة. إضافة 200 ميكرولتر من المصفوفة المغطاة المخدرات في غرفة المانحة (حلقة حمراء) من كل إدراج الأحمر و 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل غرفة الاستقبال. إعداد 3 إدراج لكل مركب اختبار (ثلاث نسخ عينات). ختم لوحة مع ختم لوحة لاصقة واحتضان عند 37 درجة مئوية على ثيرموميكسر في 200 دورة في الدقيقة (1 زغ) لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وخلط بلطف محتويات غرف المانحين والمتلقي من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا 2-3 مرات. ماصة من 20 أليكوتس ميكرولتر من جناسة من غرف المانحة وإضافة إلى 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني نظيفة في أنبوب 1.5 مل (1: 1). وبالمثل، ماصة من 20 قسامة ميكرولتر من عينات بس من غرف الاستقبال وإضافة إلى 20 ميكرولتر من جناسة نظيفة (مطابقة مصفوفة). 8 ملاحظة: مصفوفة مطابقة يلغي نإد ل 2 منحنيات المعايرة منفصلة (في جناسة و بس) ليتم إجراؤها للتحليل الكمي. وقد تتسبب محتويات غرفة المانحين في الرواسب على مر الزمن. خلط بلطف محتويات بيبتينغ قبل إزالة أليكوتس. </li></ol> 4. لك-مس الكمي وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 160 ميكرولتر من 1: 1 الميثانول: أسيتونتريل تحتوي على 500 نانوغرام / مل ديكلوفيناك أو 10 نانوغرام / مل فيراباميل (معيار داخلي) إلى كل أنبوب ودوامة لترسيب البروتينات. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق لرسوبيات راسب ونقل سوبرناتانتس إلى 96 جيدا جيدا لوحات عميقة للتحليل اللوني السائل الطيف الكتلي (لمس) التحليل. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء منحنيات المعايرة من 1-1،000 نانومتر لكل مجمع اختبار مع الحفاظ على نفس تكوين المصفوفة كما العينات أعلاه. تحديد تركيز مركب الاختبار في عينات من غرف المانحين والمستقبلات باستخدام طريقة لك-مس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احسب الجزء غير المنضم ( f u ) oو المخدرات في المصفوفة المخففة باستخدام المعادلة 1. حساب و u في مصفوفة غير مخفف باستخدام المعادلة 2 ( D = عامل التخفيف من 10). 14 <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من الانتعاش (توازن الكتلة) من كل مركب باستخدام المعادلة 3 لتحديد المركبات مع الاستقرار / الأيض / قضايا ملزمة غير محددة. ملاحظة: الانتعاش عادة ما يتراوح بين 70٪ و 130٪. 15 <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

لا توجد مصالح مالية متنافسة.

الآفات الميتة الرئوية والتجويف في المرضى المصابين بالسل تحتوي على مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا التي تعاد إلى العلاج من تعاطي المخدرات. النوى الحلقية لهذه الهياكل هي المسؤولة بشكل خاص عن إيواء هذه بيرسيسترس في بيئة خارج الخلية. ويعتقد أن التوزيع المواتي لعوامل مضادة للبكتيريا في هذه المواقع النائية يعتبر عاملا هاما في تحديد فعالية أدوية السل. قبل التحقق من صحة هذا البروتوكول، لم تكن هناك تقنيات في المختبر المتاحة التي يمكن التنبؤ بتوزيع مركبات اكتشاف المخدرات في الآفا...

علاج مرض السل الرئوي يتطلب التوزيع الفعال للأدوية إلى أنواع مختلفة من الآفات. آفات الميتة وتجاويف تحتوي على مراكز الجبني التي تأوي مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا &#39;دائمة&#39; أو متسامحة المخدرات. ويرتبط 1، 2 مرض جوفي مع معدلات الشفاء متدنية وسوء أحوال الطقس. وقد أظهرت 3 و 4 دراسات سابقة، وذلك باستخدام التقنيات الكمية والتصوير، أن القدرة على اختراق caseum تختلف بشكل كبير من الطبقة دواء واحد إلى آخر. 5، 6 هذه الطرق، ومع ذلك، تتطلب استخدام نماذج العدوى الحيوانية التي تكون بطيئة ومملة. وقد تم تصميم مقايسة في المختبر الذي يقيس المخدرات ملزمة لخارج الحي caseum. هذا الربط وجدت لربط عكسيا مع انتشار المخدرات في حبيبية الجبني، وبالتالي، هوتستخدم كأداة تنبؤية. 7 ويعتبر التوازن غسيل الكلى نهج الذهب القياسية لبروتينات البلازما الدراسات ملزمة. يوفر جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) نظام سريع وسهل الاستخدام وموثوق به لإجراء مثل هذه المقايسات. 8 يتكون الجهاز من مكونين: واحد-- استخدام، المتاح إدراج تتألف من 2 غرف مفصولة اسطوانة عمودية من غشاء شبه-- نفاذية؛ و لوحات قاعدة يمكن إعادة استخدامها التي يمكن أن تعقد ما يصل إلى 48 إدراج في وقت واحد. غشاء غسيل الكلى لديه 8 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (موكو) التي هي مثالية للدراسات ملزمة جزيء المخدرات. ارتفاع نسبة مساحة إلى حجم وحدة من غشاء مقصورة يسمح الغسيل السريع و موازنة. وقد تم التحقق من كل من إدراج ولوحة قاعدة للحد الأدنى ملزمة غير محددة. الجمع بين الجهاز الأحمر مع تقنيات بيواناليتيكال يوفر تقديرات دقيقة للكسور غير منضم من المخدرات في صlasma. 8 ، 9 على الرغم من أن أصلا مصممة لقياس بروتين البلازما ملزمة، وقد تم استخدام الجهاز الأحمر في العديد من الدراسات ملزمة الأنسجة باستخدام التجانس. 10 ، 11 في هذا البروتوكول، نقيس المخدرات ملزمة لكاسيوم، الحطام نخرية استئصال من الآفات نخر وتجويف الأرانب المصابة بالسل. طبيعة خلوية وغير الأوعية الدموية من المواد الكاجي يجعل من السهل التجانس في تعليق متجانسة التي تتوافق مع الفحص. وبالنظر إلى أن كاسيوم مملة لإنتاج ويصعب أن تأتي من قبل، كما تم التحقق من صحة البروتوكول لاستخدامها مع مصفوفة بديلة التي يتم إعدادها من البلاعم رغوي. وتتسبب الضامة المستمدة من خلية واحدة من ثب-1 بحمض الأوليك لتراكم أجسام دهنية متعددة تعطيها مظهرها &quot;الرغوي&quot;. يتم حصاد هذه الخلايا محملة الدهون ومعالجتها لإنتاج مصفوفة التي نستخدمها كبديل ل كاسوم. وقد أظهرت هذه الدراسة أن المخدرات ملزمة لهذه المصفوفة البديلة يرتبط بشكل جيد مع ملزم إلى الكالسيوم، محاكاة على نحو فعال في عملية الجسم الحي الذي يعيق اختراق المخدرات في جوهر الكاحل من حبيبي وتجويف.

<table><tbody><tr><td>نيوزيلندا الأرانب البيضاء</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>المتفطرة السلية</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>كيتاثيسيا (كيتامين) 100 مجم / مل C3N</td><td>هنري شاين لصحة</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 مجم / مل</td><td>هنري شاين لصحة</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (البنتوباربيتال الصوديوم والفينيتوين الصوديوم) محلول &nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 خط الخلايا أحادي</td><td>الخلية ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 سم &SUP2 ؛ قارورة TC-المعالجة (T175)</td><td>فيشر Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 وسائط بدون جلوتامين</td><td>فيشر Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone مصل الأبقار الجنينية ، جاما مشع &nbsp ؛</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>هيكلون إل جلوتامين ، 200 ملي</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>طبق سيلستار TC ، 145 مم × 20 مم ، فيشر</td><td>ساينتفيك</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) فيشر</td> <td>سينتيفك</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك</td><td>سيجما</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>حمض الأوليك&nbsp;</td><td>فيشر ICN15178101</td><td></td><td></td>العلمي</tr><tr><td>بيرس RED جهاز قابلة لإعادة الاستخدام لوحة قاعدة</td><td>فيشر Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>بيرس RED إدراج الجهاز ، 50 / صندوق &nbsp ؛</td><td>فيشر العلمي</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>بيرس RED إدراج أداة إزالة &nbsp;</td><td>فيشر Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>ختم اللوحة اللاصقة</td><td>فيشر Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 10 × 500 مل (Gibco) &nbsp ؛</td><td>لايف تكنولوجيز&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac ملح الصوديوم</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪</td> <td>فيشر ساينتفيك</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول ، 200 دليل</td><td>فيشر العلمي</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 جينو / مطحنة</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>مطحنة الخرز الخالط التبعي ، الخرز السائبة المعدنية</td><td>فيشر Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R الكوبالت 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO & nbsp ؛ C-Chip مقاييس الدم القابل للتصرف</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>مجهر ضوئي مستقيم</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>نظام كروماتوغرافيا السائل الثنائي</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>مطياف الكتلة</td> متعدد المطابقة <td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

ويتطلب القضاء على مرض السل وجود نظم أدوية يمكن أن تخترق الطبقات المتعددة من الآفات الرئوية المعقدة. توزيع المخدرات في النوى الكاحل من تجاويف والآفات هو أمر بالغ الأهمية خاصة لأنها تؤوي مجموعات فرعية من البكتيريا المتسامحة للدواء أيضا يشار إليها عادة باسم بيرسيسترس. الطرق الحالية لقياس اختراق المخدرات في الآفات السل تنطوي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا في الدراسات الدوائية الحيوي إلى جانب تقنيات بيواناليتيكال أو التصوير. واقترح في المختبر قياس المخدرات ملزمة لجزيئات كاسيوم كبديل لهذه التقنيات منذ هذا الربط يعيق الانتشار السلبي لجزيئات الدواء من خلال الكالسيوم. التوازن السريع غسيل الكلى هو نظام سريع وموثوق بها لأداء بروتين البلازما والدراسات ملزمة الأنسجة. في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) لقياس المخدرات ملزمة لمجانسة من الكالسيوم وهذا هو زيسمن آفات وتجويف الأرانب المصابة بالسل. يصف البروتوكول أيضا كيفية إنشاء مصفوفة بديلة من الدهون تحميل ثب-1 الضامة لاستخدامها بدلا من الكالسيوم. هذا فحص الكالسيوم / البديل ملزمة هو أداة هامة في اكتشاف المخدرات السل ويمكن تكييفها للمساعدة في دراسة توزيع المخدرات في الآفات أو الخراجات الناجمة عن أمراض أخرى.

باستخدام هذا البروتوكول، قمنا باختبار مئات من مركبات تطوير المخدرات السل للكفاءة المتوقعة في اختراق الكالسيوم. الشكل 1 يتصور المفاهيم الأساسية للمقايسة الحمراء. غشاء غسيل الكلى من إدراج الأحمر يسمح للجزيئات الصغيرة غير منضم إلى منتشر من المتبرع جيدا إلى جهاز الاستقبال بشكل جيد، وأخيرا تحقيق التوازن بين كل من المقصورات. وتحاصر الجزيئات الصغيرة التي ترتبط بجزيئات كبيرة مثل البروتينات أو الدهون في البئر المانحة. التحليل الكمي للعينات ...

نحن هنا تصف طريقة التوازن السريع (ريد) غسيل الكلى لقياس المخدرات ملزمة لكازيوم من آفات السل الرئوي والتجويف. يستخدم البروتوكول أيضا مع مصفوفة مستمدة بلعم رغوي الذي هو بديل فعال ل كاسوم.

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو التنبؤ بارتباط الدواء بالمادة الجبنية الناتجة عن الآفات السلية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في تحديد مدى فعالية اختراق مضادات الميكروبات لمركز المادة الجبنية في الآفات النخرية دون استخدام النماذج الحيوانية وتقنيات التصوير الباهظة. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية ثاقبة في الاكتشاف المباشر لعلاجات السل، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أمراض أخرى تتميز بتكوّن آفات أو خراجات يكون فيها اختراق الدواء محدوداً.يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن الاتساق في تنفيذ البروتوكول سيضمن إمكانية تكرار البيانات بين التجارب. سأقوم اليوم بشرح إجراء استنبات الخلايا وتحضير المصفوفة البديلة. وسيقوم Hsin-pin، وهو باحث مشارك في مختبرنا، بشرح المقايسة المتبقية.قم بتنمية خلايا THP-1 أحادية النواة في دوارق زراعة خلايا T-175 تحتوي على 80 mL من وسط RPMI 1640، مع 2 millimolar من l-glutamine و10% من مصل جنين البقر. قم بتحضين الدوارق عند 37 °C مع 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام. بمجرد أن تصل الخلايا إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 70%، قم بتقسيمها إلى أنبوبين مخروطيين سعة 50 mL، ثم قم بطردها مركزياً عند 150 ×g لمدة خمس دقائق.بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وقم بتعليق الراسب في 10 mL من وسط RPMI 1640. انقل باستخدام الماصة 5 µL من هذه المزرعة إلى أنبوب سعة 1.5 mL يحتوي على 45 µL من صبغة trypan blue. اخلط جيداً عن طريق السحب والضخ بالماصة.انقل 10 µL إلى مقياس كريات الدم (hemocytometer). وباستخدام مجهر ضوئي بقوة تكبير 10x، قم بعدد الخلايا الوحيدة THP-1 الحيوية. وبعد تحديد عدد الخلايا الحيوية لكل ملليلتر من المزرعة، خففها باستخدام وسط RPMI لتصل إلى كثافة نهائية تبلغ 1.25 × 10⁶ خلية لكل ملليلتر.أضف 40 µL من PMA بتركيز 100 µM إلى الأنبوب. ثم انقل المزرعة إلى طبق زراعة خلايا بمقاس 140 × 20 mm. اترك الخلايا لتلتصق طوال الليل في الحاضنة.بعد ذلك، يتم تخفيف حمض الإلياك (iliac acid) النقي في الإيثانول ليصل تركيزه إلى 0.1 molar. وفي هذه الخطوة، يتم إذابة 31.7 µL من حمض الإلياك في 968.3 µL من الإيثانول. ثم يُخفف المحلول في وسط RPMI طازج ومسخن مسبقاً ليصل التركيز إلى 10 millimolar.خفف معلق حمض الإلياك (iliac acid) ليصل إلى تركيز عمل نهائي قدره 0.4 millimolar في وسط RPMI المسخن مسبقاً إلى 37 degrees Celsius. يعد تخفيف حمض الإلياك في وسط RPMI المسخن مسبقاً أمراً بالغ الأهمية لضمان الذوبان الكافي للحمض الدهني في محلول مائي. وباستخدام الماصة، قم بإزالة الوسط الموجود والخلايا غير الملتصقة من طبق زراعة الخلايا الذي يحتوي على البلاعم THP-1، ثم أضف برفق 40 mL من حمض الإلياك بتركيز 0.1 millimolar.يُحضّن في الحاضنة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، يُستخدم مجهر ضوئي بقوة تكبير 40x للتأكيد بصرياً على وجود العديد من اشتمالات الأجسام الدهنية في خلايا THP macrophage. وتظهر الأجسام الدهنية كهياكل كروية شفافة وصغيرة في السيتوبلازم.قم بإزالة جميع وسط RPMI من طبق زراعة الخلايا واغسل الخلايا الملتصقة برفق مرتين باستخدام PBS، وذلك باستعمال ماصة سيرولوجية سعة 50 mL. أضف 40 mL من 5 millimolar EDTA و PBS إلى الطبق. قم بالتحضين لمدة 15 دقيقة عند 37 degrees Celsius.بعد ذلك، لفصل البلاعم الرغوية، استخدم ماصة سيرولوجية سعة 10 mL وقم بعملية السحب والضخ بشكل متكرر فوق سطح الطبق بالكامل. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL، ثم قم بطرده مركزياً عند 150 ×g لمدة خمس دقائق.بعد عملية الطرد المركزي، أعد تعليق كتلة الخلايا في 10 mL من PBS وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL موزون مسبقاً. قم بإجراء الطرد المركزي مرة أخرى عند 150 ×g لمدة خمس دقائق. ثم اسحب الطافي بعناية باستخدام ماصة سيرولوجية وتخلص منه.أخضع أقراص البلاعم الرغوية لثلاث دورات تجميد وإذابة سريعة. بدّل بين الثلج الجاف والحضن عند 37 درجة مئوية على كتلة حرارية لتحليل الخلايا. بعد ذلك، احضنها عند 75 درجة مئوية لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة لمسخ البروتينات الموجودة في المصفوفة.تُخزن الأطباق عند درجة حرارة -20 °C حتى وقت الحاجة إليها. يمكن إجراء مقايسة أجهزة التوازن السريع، أو مقايسة RED الموضحة في هذا القسم من الفيديو، باستخدام إما المصفوفة البديلة التي أعددناها للتو أو عينات من آفات الأرانب المصابة بـ TB. سنقوم هنا بعرض المقايسة كما تُجرى على المصفوفة البديلة.قم بتحضير محاليل مخزنة بتركيز 10 millimolar من جميع المركبات المختبرة. في هذه الحالة، يتم تحضير moxyfloxacin في DMSO. ثم خفف المحاليل إلى محاليل عمل بتركيز 500 micromolar في DMSO قبل كل مقايسة.قم بوزن الأنبوب الذي يحتوي على الجبن المقطوع (caseum) أو البديل المستخدم. اطرح وزن الأنبوب الفارغ لاستخراج وزن الجبن أو البديل بمفرده. أضف من خرزتين إلى ثلاث خرزات معدنية لكل أنبوب، ثم أضف PBS بنسبة 1:9 (وزن إلى حجم). وباستخدام جهاز الرج (vortex)، قم بتفتيت الجبن أو مصفوفة البديل لمدة دقيقة واحدة.أضف 6.5 µL من المركب المختبر المُحضّر إلى 643.5 µL من المتجانس، وذلك للوصول إلى التركيز النهائي وهو 5 µM، ثم استخدم جهاز الـ vortex. بعد ذلك، ضع الحشوات الحمراء في الصفيحة الأساسية.قم بتجهيز الغرسات لكل اختبار، بحيث يكون كل مركب في ثلاث مكررات. أضف 200 µL من المصفوفة المضاف إليها الدواء في حجرة المانح الحمراء لكل غرسة حمراء. ثم أضف 350 µL من PBS في كل حجرة مستقبلة.ضع سدادة لاصقة على الصفيحة وقم بحضنها عند 37 درجة مئوية في الخلاط الحراري بسرعة 200 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات. بعد فترة الحضن، اخلط محتويات حجرات المانح والمستقبل بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة من مرتين إلى ثلاث مرات. انقل 20 µL من المتجانس من كل حجرة من حجرات المانح إلى 20 µL من محلول PBS النظيف في أنبوب سعة 1.5 mL.وبالمثل، يتم نقل حصص مقدارها 20 µL من عينات PBS من غرف الاستقبال إلى 20 µL من المستخلص المتجانس النقي. وتعمل مطابقة المصفوفة على إلغاء الحاجة إلى إنشاء منحنيين منفصلين لرؤية الألوان في كل من المستخلص المتجانس وPBS من أجل التحليل الكمي. وتترسب محتويات غرفة المانح بمرور الوقت.امزج المحتويات بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة قبل سحب الأجزاء المطلوبة. أضف 160 µL من خليط الميثانول إلى الأسيتونتريل بنسبة 1:1، والذي يحتوي على 500 ng/mL من diclofenac أو 10 ng/mL من verapamil، إلى كل أنبوب كمعيار داخلي. استخدم جهاز Vortex لترسيب البروتينات.قم بإجراء عملية الطرد المركزي عند 10000 x g لمدة خمس دقائق لترسيب الراسب، ثم انقل السوائل الطافية إلى ألواح ذات آبار عميقة سعة 96 بئراً لتحليلها باستخدام مطيافية الكتلة الكروماتوغرافية السائلة، LCMS. قم بإنشاء منحنيات معايرة تتراوح من 1 إلى 1000 nanomolars لكل مركب اختباري عن طريق إجراء تخفيفات للمحلول المخزون للمركب مع الحفاظ على نفس تكوين المصفوفة المستخدم في العينات. قم بتحديد تركيز المركب الاختباري في العينات المأخوذة من حجرتي المانح والمستقبل باستخدام طريقة LCMS.احسب الجزء غير المرتبط، أو fu، للدواء والمصفوفة المخففة، باستخدام المعادلة رقم واحد الموضحة هنا. ثم احسب fu في المصفوفة غير المخففة باستخدام المعادلة رقم اثنين، حيث D تساوي عامل تخفيف قدره 10. وأخيرًا، تحقق من الاستعادة أو توازن الكتلة لكل مركب باستخدام المعادلة رقم ثلاثة الموضحة هنا.لتحديد المركبات التي تعاني من مشكلات في الاستقرار أو التمثيل الغذائي أو الارتباط غير النوعي. يرجى ملاحظة أن نسبة الاسترداد تقع عادةً بين 70% و130%. لقد استُخدم البروتوكول الموضح في هذا الفيديو لاختبار مئات المركبات المستخدمة في تطوير أدوية السل لتقييم كفاءتها المتوقعة في اختراق الجبن (caseum).يسمح غشاء الديلزة في الحشوات الحمراء للجزيئات الصغيرة غير المرتبطة بالانتشار من بئر المانح إلى بئر المستقبل، وصولاً في النهاية إلى حالة توازن بين كلا الحجرتين. أما الجزيئات الصغيرة المرتبطة بجزيئات كبيرة مثل البروتينات أو الدهون، فتظل محتجزة في بئر المانح. ويتيح التحليل الكمي للعينات المأخوذة من كلتا الحجرتين حساب الجزء غير المرتبط، fu، لكل جزيء صغير في الجبن الرئوي (caseum) أو المصفوفة البديلة، كما هو موضح هنا.كلما ارتفعت قيمة fu، زاد انتشار الدواء بشكل أوسع في المادة الجبنية. تم إجراء تصوير مطيافية الكتلة بامتزاز/تأين الليزر بمساعدة المصفوفة، أو MALDI، لستة أدوية. تظهر هنا خرائط أيونية لآفات رئوية ممثلة، حيث يتم الإشارة إلى شدة الإشارة بواسطة شريط المقياس الموجود على اليسار.يظهر أدناه صبغ الهيماتوكسيلين وESN أو HNE للمقاطع المتجاورة. وتبرز خطوط الكنتور باللونين الأبيض والأسود المركز الجبني لكل آفة. وتتوافق هذه البيانات مع الفرضية القائلة بأن جزيئات الدواء تنتشر في الغرفة الخارجية للمادة الجبنية من واجهتها مع الطبقات الخلوية للآفة.يؤدي الارتباط بالجزيئات الكبيرة الجبنية إلى احتجاز الدواء، مما يمنعه من المزيد من الانتشار إلى اللب الجبني. كما هو موضح هنا، فإن المصفوفة المُعدة من البلاعم الرغوية المشتقة من خلايا THP-1 تُعد بديلاً فعالاً للمادة الجبنية الحقيقية. ويرتبط الارتباط في كلتا المصفوفتين ببعضهما البعض ارتباطاً قوياً.باتباع هذا الإجراء، يمكن اختبار عدة مركبات في آن واحد لتوفير الوقت والموارد، وهو ما نسميه الاختبار بنظام الكاسيت (cassette testing). ومنذ تطوير هذا المقايسة، تم استخدامها في العديد من برامج تحسين المركبات الرائدة لاكتشاف أدوية علاج السل.لا تنسَ أن التعامل مع البكتيريا الدقيقة وعينات الأنسجة المصابة بمرض السل يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب استخدام بروتوكول معتمد لتعقيم الأنسجة باستخدام أشعة غاما قبل التعامل مع عينات الأغلفة المصابة في مختبر من مستوى السلامة البيولوجية الثاني BSL2. شكراً للمشاهدة ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

المصدر: Sarathy، J. P. et al. مقايسة ربط الجبال في المختبر التي تتنبأ باختراق الدواء في آفات السل. J. Vis. خبرة. (2017)يوضح هذا الفيديو مقايسة في المختبر لقياس ارتباط الدواء بالجبن من آفات السل باستخدام غسيل الكلى السريع بالتوازن السريع. يحدد خطوات تحضير معلقات الجبن ، وإجراء غسيل الكلى ، وحساب جزء الدواء غير المرتبط للتنبؤ بتغلغل الدواء في الجبن.

قياس ارتباط الدواء بالجسام من آفات السل عبر طريقة غسيل الكلى بالتوازن السريع

يوضح هذا الفيديو فحصا لتقييم فعالية الأدوية ضد عدوى المتفطرة السلية (Mtb). يتم إنشاء نموذج عدوى في المختبر يحتوي على مجاميع Mtb / البلاعم التي تحاكي العدوى في الجسم الحي. عند إدخال المضادات الحيوية المناسبة ، يتم اختبار فعاليتها عن طريق مقايسة ريسوزارين لمراقبة بقاء البكتيريا مع زيادة تركيزات الأدوية.

اختبار لتقييم فعالية الدواء ضد نموذج عدوى المتفطرة السلية

يوضح هذا الفيديو فحصا في المرق لتحديد فعالية المضادات الحيوية ضد المتفطرة السلية. يتم تحضين الثقافة البكتيرية بتركيزات مختلفة من مضاد حيوي مبيد للجراثيم. يتم قياس فعالية مبيد الجراثيم من خلال تقييم وجود بكتيريا قابلة للحياة باستخدام مقايسة ريزازورين.

تقييم فعالية مركب الاختبار ضد البكتيريا الفطرية في المرق

هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

charcoal agar resazurin assay (CARA) هي طريقة شبه كمية متوسطة الإنتاجية لتقييم نشاط عوامل الاختبار ضد البكتيريا الفطرية التي تتكاثر أو لا تتكاثر أو كليهما.  يسمح CARA بالتقييم السريع للنشاط المعتمد على الوقت والتركيز ويحدد المعلمات التي يجب متابعتها بواسطة فحوصات وحدة تشكيل المستعمرة (CFU).

التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

لقد قمنا بتطوير نظام الفحص الإنتاجية العالية وحدات لاكتشاف مركبات جديدة ضد السل المتفطرة، تستهدف داخل وفي مرق تزايد البكتيريا وكذلك السمية الخلوية ضد الخلية المضيفة الثدييات.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

النماذج والمقايسات الجديدة التي من شأنها تحسين عملية تطوير الأدوية المبكرة للأدوية من الجيل التالي من الأدوية المضادة للسل مرغوبة للغاية. هنا ، نصف مقايسة سريعة وغير مكلفة ومتوافقة مع BSL-2 لتقييم فعالية الدواء ضد المتفطرة السلية التي يمكن تكييفها بسهولة للفحص عالي الإنتاجية.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام الليزر التقاط ميكروديسيكشن مقترنة بتحليل LC/MS مكانياً كمياً-توزيع المخدرات داخل حبيبية السل الرئوي. وقد النهج انطباق واسع لقياس تركيزات المخدرات داخل الأنسجة في التفاصيل المكانية العالية.

التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

تحديد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) هو الأسلوب القياسي الذهبي لقياس البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرة السلية التي قد تستغرق أسابيع لتشكيل مستعمرات مرئية. هنا نصف وحدة CFU الصغيرة لتحديد CFU مع زيادة كفاءة الوقت ، وتقليل مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، وقابلية التوسع في تجارب الإنتاجية المتوسطة والعالية.

فحص وحدة تشكيل المستعمرات الدقيقة لتقييم فعالية اللقاحات ضد السل

طورت هذه الدراسة اختبارا للفحص عالي الإنتاجية ضد خراج المتفطرة مع سلالة مراسل مزدوجة تم إنشاؤها مؤخرا ، باستخدام التألق واللألؤ لتقييم صلاحية البكتيريا بسرعة. سيكون هذا البروتوكول مناسبا للباحثين الذين يهدفون إلى فحص الأدوية الجديدة ضد هذه البكتيريا المقاومة للأدوية.

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية

تعلم تقنية التحلل السريع للتوازن لقياس ارتباط الأدوية بكازيوم آفات السل الرئوي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على تقييم اختراق المضادات الحيوية في الآفات التنخرية بدون نماذج حيوانية.

ل

استكشف المزيد من الفيديوهات