إعداد و

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقديم تقنية تضمن تعديل الخلايا باستخدام microRNA وبالتوازي مع مغنطة الخلايا. يمكن لهذه الطريقة معالجة تحديات رئيسية في مجال الطب التجديدي، مثل الهندسة الوراثية للخلايا قبل عملية الزرع.

بالإضافة إلى التعديل الخلوي الفعال باستخدام microRNA، فقد سمحوا بذلك باستخدام أكسيد الحديد. ويمكن استخدام ذلك لتعزيز استبقاء الخلايا في المنطقة المستهدفة عن طريق تطبيق مجال مغناطيسي. ويعد العلاج الخلوي واعداً جداً لعلاج أمراض القلب، وهناك حاجة ملحة لتحسين ضعف استبقاء الخلايا وبقائها على قيد الحياة.

ابدأ هذا الإجراء بزراعة خلايا بطانية من وريد الحبل السري البشري تمهيداً لتحضير معقدات عفن التحول كما هو موضح في البروتوكول النصي. قبل 48 ساعة من عملية عفن التحول، قم بستزراع خلايا HUVECs على أطباق زراعة خلوية بلاستيكية ذات أحجام مناسبة، بكثافة خلوية بدائية تبلغ حوالي 13,000 خلية لكل سنتيمتر مربع من سطح النمو.

بعد ذلك، قم بتحضير جسيمات نانوية طازجة من miR/polyethyleneimene/أكسيد الحديد فائقة المغناطيسية. أولاً، قم بتخفيف 2.5 picomoles من microRNA لكل سنتيمتر مربع من سطح نمو الخلايا ومحلول جلوكوز بتركيز 5% للحصول على تركيز نهائي قدره 0.125 picomoles من microRNA لكل µL. بعد ذلك، قم بتخفيف PEI في حجم مساوٍ من محلول جلوكوز بتركيز 5%.

أضف PEI المخفف إلى محلول microRNA وقم برج المزيج الناتج باستخدام جهاز الـ vortex لمدة 30 ثانية. ثم حضن مزيج miR/PEI لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بمعالجة MNP's بالموجات فوق الصوتية لمدة 20 دقيقة على الأقل في حمام الماء بالموجات فوق الصوتية في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف الكمية المناسبة من محلول MNP إلى خليط miR/PEI الجاهز. بعد الرج باستخدام جهاز vortext لمدة 30 ثانية، يتم التحضين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف خليط miR/PEI/MNP المُحضّر قطرة تلو الأخرى مباشرة إلى وسط استزراع الخلايا.

استبدل هذا المزيج بوسط زرع جديد بعد ست ساعات من عملية عفن الخلايا (transfection). وبعد تحليل سلامة الناقل كما هو موضح في البروتوكول النصي، قم بتأكيد وتوصيف التموضع داخل الخلوي لمعقدات عفن الخلايا باستخدام المجهر البؤري ومجهر الإضاءة المهيكلة فائقة الدقة. وللقيام بذلك، قم بزراعة خلايا HUVECs على غطاءات زجاجية مغلفة بالجيلاتين موضوعة في آبار أطباق زرع ذات 24 بئراً كما سبق.

قم بنقل miR/PEI/MNP المسمى بثلاثة ألوان إلى الخلايا، ثم احضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. اغسل شرائح التغطية أولاً باستخدام ألبومين مصل بقري بنسبة 2% ومحلول ملحي منظم بالفوسفات، ثم باستخدام PBS فقط. قم بتثبيت الخلايا عن طريق التحضين في بارافورمالدهيد أو PFA بنسبة 4% عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

اغسل باستخدام PBS ثم صبغ النوى بـ DAPI وفقاً للبروتوكولات القياسية. بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة على الهزاز لإزالة الصبغة الزائدة. ضع أغطية الشرائح المُحضرة على شرائح مجهرية باستخدام وسط تثبيت مناسب واترك الشرائح تجف لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل استخدامها في الفحص المجهري.

قم بالتقاط الصور باستخدام عدسة شيئية غمر زيتية بقوة 63 مرة وفقاً لإعدادات SIM الموضحة في البروتوكول النصي. ولاستهداف الخلايا ومحاكاة الظروف الديناميكية في المختبر، قم أولاً بنقل خلايا HUVECs عبر عفن (transfect) إلى طبق يحتوي على 24 بئراً كما سبق. وبعد تحضينها لمدة 24 ساعة، قم بغسل الخلايا.

ثم أضف 1x trips in EDTA مخففاً في PBS واحضن الخلايا لمدة أربع دقائق عند 37 °C قبل جمع الخلايا. قم بطرد الخلايا المجموعة مركزياً عند 300 ×g لمدة 10 دقائق. امزج كتلة الخلايا الناتجة من بئر واحد مع 1 mL من وسط استزراع جديد.

ثم يتم نقل الخلايا إلى بئر واحد في طبق يحتوي على 12 بئراً. ثبّت مغناطيساً صغيراً موضعياً باستخدام شريط لاصق. ضع طبق المزرعة على الهزاز واحضن معلق الخلايا لمدة 12 ساعة بسرعة 150 RPM لمحاكاة الظروف الديناميكية.

بعد ذلك، اغسل الخلايا وقم بتثبيتها باستخدام PFA بتركيز 4%. صبغ النوى باستخدام DAPI. سجل التصاق الخلايا باستخدام المجهر البؤري الماسح بالليزر مع ليزرات إثارة بطول 405 و 504 نانومتر في وضع z-stack للحصول على البيانات الخام.

استخدم معالجة الصور بطريقة الإسقاط الأقصى للكثافة (maximum intensity projection) لإنشاء صور للتحليل. ولإجراء التحليل الكمي للخلايا المستجيبة والمستجيبة مغناطيسياً وغير المستجيبة، قم أولاً بنقل الجينات (transfect) إلى خلايا HUVECs في طبق يحتوي على 24 بئراً. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة قبل غسلها وجمعها كما تم وصفه سابقاً.

أعد تعليق كتلة الخلايا التي تم الحصول عليها من كل بئر باستخدام 500 µL من منظم فرز الخلايا المعقم والدافئ. ضع معلق الخلايا في عمود فرز مغناطيسي مثبت بواسطة المغناطيس المرفق. ثم اغسل الأعمدة الموجودة على المغناطيس ثلاث مرات باستخدام منظم فرز خلايا جديد.

اجمع السائل المار كجزء غير مستجيب مغناطيسياً. أزل الأعمدة من المغناطيس واجمع على الفور جزء الخلايا المستجيب مغناطيسياً عن طريق دفع محلول منظم جديد لفرز الخلايا عبر العمود باستخدام مكبس. قم بطرد مركزي لكل من الجزأين Mag- و Mag+ عند 300 ×g لمدة 10 دقائق.

بعد إعادة تعليق كتلة الخلايا في PBS، قم بعدّ الخلايا وتقييم حيويتها باستخدام مقايسة استبعاد صبغة trypan blue. تتميز خلايا HUVECs، المستخلصة من الحبال السرية، بالتعبير عن المؤشر البطاني CD31 وتكوين أنابيب على مصفوفة الغشاء القاعدي. جميع خلايا HUVECs التي تم نقل miR/PEI/MNP إليها امتصت miR الموّسم.

ويظل بقاؤها على قيد الحياة غير متأثر بعد 24 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection). بالإضافة إلى ذلك، يُظهر المجهر فائق الدقة تموضع مجمعات العفن الموسومة بثلاثة ألوان في المنطقة المجاورة للنواة. كما يتم تأكيد سمية PEI من خلال تراجع الوظائف في الخلايا التي خضعت لعفن miR/PEI.

ومن الأهمية بمكان أن جزيئات النانو المغناطيسية (MNP) تعيد الخصائص الخلوية؛ إذ لا تختلف الخلايا المعدلة بـ miR/PEI/MNP عن الخلايا غير المعالجة من حيث تكوين الأنابيب. علاوة على ذلك، تحافظ هذه الخلايا على التواصل الفجوي بين الخلايا، كما كشف عن ذلك من خلال تقنية استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي.

بمجرد استزراع معلق من الخلايا المعدلة بـ miR/PEI/MNP في آبار طبق زراعة موضوع على هزاز دوار، تميل الخلايا إلى الهجرة والالتصاق في منطقة تطبيق المغناطيس الموضعي. وتوضح الصور التمثيلية نمو الخلايا في المنطقة التي تم تطبيق المغناطيس فيها، وفي المنطقة التي لم يتم تطبيق المغناطيس فيها.

وفي مركز بئر الزرع حيث كان تدفق السائل يركز الخلايا. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إجراء عملية ترانسفكشن الخلايا في غضون ساعتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد جداً عن كيفية تعديل الخلايا البطانية بشكل عابر ولكن بكفاءة عالية، بما في ذلك عملية المغنطة.

وكيفية إجراء التوصيف النهائي للمنتج الخلوي. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم الالتزام بالأرقام المحددة لكميات زراعة الخلايا ومكونات تحضير معقدات عفن الخلية (transfection complexes)، ووقت الحضانة، وخطوة الغسيل التي تلي عملية عفن الخلية. ونحن متفائلون جدًا بأن هذا النهج سيكون قابلاً للنقل بفعالية إلى أنواع أخرى من الخلايا لعلاج الأعضاء المصابة الأخرى.

بناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء دراسات داخل الجسم الحي باستخدام خلايا ممغنطة معدلة. ويمكن لهذه الدراسات أن تجيب على أسئلة إضافية حول ما إذا كان تحميل الخلايا بالحديد فعالاً لضمان استبقائها في المنطقة المستهدفة، وكذلك لتحديد حدود الكشف باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي داخل الجسم الحي.