إعداد و في المختبر توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إدخال تقنية تضمن تعديل الخلية باستخدام microRNA ومغنطة الخلايا المتوازية. يمكن لهذه الطريقة أن تعالج التحديات الرئيسية في مجال الطب التجديدي. مثل الهندسة الوراثية للخلايا قبل الزرع.

بالإضافة إلى التعديل الفعال للخلايا باستخدام microRNA ، سمحوا لها بأكسيد الحديد. يمكن استخدام هذا لتعزيز الاحتفاظ بالخلايا في جانب الاهتمام عن طريق تطبيق المجال المغناطيسي. العلاج الخلوي واعد جدا لعلاج أمراض القلب ، والاحتفاظ بالخلايا السفلية ، وبقاء الخلايا بحاجة ماسة إلى تحسين.

ابدأ هذا الإجراء بزراعة الخلايا البطانية للوريد السري البشري لتحضير مجمعات التعدي كما هو موضح في بروتوكول النص. قبل 48 ساعة من التعدي ، قم بزرع HUVECs على ألواح بئر زراعة الخلايا البلاستيكية ذات الحجم المناسب. مع كثافة خلية تبدأ تبلغ حوالي 13،000 خلية لكل سنتيمتر مربع من سطح النمو.

بعد ذلك ، قم بإعداد الجسيمات النانوية الطازجة miR / البولي إيثيلين / المغناطيسية الفائقة من أكسيد الحديد. قم أولا بتخفيف 2.5 بيكومول من microRNA لكل سنتيمتر مربع من سطح نمو الخلية وخمسة بالمائة من محلول الجلوكوز للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.125 بيكومول من microRNA لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، قم بتخفيف PEI بحجم متساو من محلول الجلوكوز بنسبة خمسة بالمائة.

أضف PEI المخفف إلى محلول microRNA وقم بتدوير الخليط الذي تم الحصول عليه لمدة 30 ثانية. ثم احتضان خليط miR / PEI لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Sonicate MNP لمدة 20 دقيقة على الأقل في الحمام المائي الصوتنة في درجة حرارة الغرفة.

ثم أضف الكمية المناسبة من محلول MNP إلى خليط miR / PEI الجاهز. بعد الدوامة لمدة 30 ثانية ، احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف خليط MIR / PEI / MNP المحضر مباشرة إلى وسط الثقافة على الخلايا.

استبدل هذا الخليط بوسط ثقافة طازجة بعد ست ساعات من التعداد. بعد تحليل سلامة المتجهات كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بتأكيد وتوصيف التوطين داخل الخلايا لمجمعات التعدي عن طريق الفحص المجهري للإضاءة الهيكلية متحد البؤر وفائق الدقة. للقيام بذلك ، قم بزرع HUVECs على زلات غطاء زجاجي مطلي بالجيلاتين موضوعة في آبار ألواح استزراع 24 بئرا كما كان من قبل.

قم بنقل الخلايا ب 3 ألوان تحمل اسم MIR / PEI / MNP واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. اغسل زلات الغطاء أولا باستخدام اثنين بالمائة من ألبومين مصل الأبقار ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، ثم باستخدام PBS فقط. قم بإصلاح الخلايا عن طريق احتضان أربعة بالمائة من بارافورمالدهيد أو PFA عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

اغسل باستخدام PBS ثم قم بتلطيخ النوى باستخدام DAPI باتباع البروتوكولات القياسية. ثم اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات 15 دقيقة على شاكر لإزالة الصبغة الزائدة. ضع زلات الغطاء المحضرة على شرائح المجهر باستخدام وسيط تركيب مناسب واترك الشرائح تجف لمدة ساعة على الأقل قبل استخدامها للفحص المجهري.

احصل على الصور باستخدام هدف الغمر بالزيت 63 مرة في إعدادات بطاقة SIM الموجودة في بروتوكول النص. لاستهداف الخلايا والظروف الديناميكية المحاكاة في المختبر ، قم أولا بنقل HUVECs إلى صفيحة 24 بئرا كما كان من قبل. بعد احتضانها لمدة 24 ساعة ، اغسل الخلايا.

ثم أضف رحلة x واحدة في EDTA المخففة في PBS واحتضان الخلايا لمدة أربع دقائق عند 37 درجة مئوية قبل جمع الخلايا. الطرد المركزي للخلايا المجمعة عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق. امزج حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها من بئر واحد مع ملليلتر واحد من وسط الاستزراع الطازج.

وانقل الخلايا إلى بئر واحد من صفيحة 12 بئرا. إصلاح مغناطيس صغير محليا باستخدام الشريط. ضع لوحة الثقافة على الخلاط واحتضن تعليق الخلية لمدة 12 ساعة عند 150 دورة في الدقيقة لمحاكاة الظروف الديناميكية.

ثم اغسل الخلايا وقم بإصلاحها باستخدام أربعة بالمائة من PFA. تلطخ النوى ب DAPI. سجل مرفق الخلية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام ليزر إثارة 405 و 504 نانومتر في وضع z-stack للحصول على البيانات الأولية.

استخدم معالجة صور الإسقاط القصوى لإنشاء صور للتحليل. للتحليل الكمي للخلايا الإيجابية مغناطيسيا وغير المستجيبة ، قم أولا بنقل HUVECs في صفيحة مكونة من 24 بئرا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة قبل غسل الخلايا وجمعها كما هو موضح سابقا.

أعد تعليق حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها من كل بئر ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لفرز الخلايا المعقمة الدافئة. ضع تعليق الخلية على عمود فرز مغناطيسي مثبت بواسطة المغناطيس المرفق. ثم اغسل الأعمدة الموجودة على المغناطيس ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت جديد لفرز الخلايا.

اجمع التدفق على أنه جزء غير مستجيب مغناطيسيا. قم بإزالة الأعمدة من المغناطيس واجمع على الفور جزء الخلية المستجيب مغناطيسيا عن طريق دفع المخزن المؤقت لفرز الخلايا الجديد ، اعتقد العمود باستخدام المكبس. جهاز الطرد المركزي كل من كسور Mag و Mag + عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق.

بعد إعادة تعليق حبيبات الخلية في PBS ، قم بحساب الخلايا وتقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة استبعاد trypan blue. معزولة عن الحبل السري ، تتميز HUVECs بالتعبير عن علامة البطانة CD31 وتكوين أنابيب على مصفوفة غشاء القاعد. HUVECs المنقولة باستخدام miR / PEI / MNP كلها تأخذ miR الموسومة.

ويظل بقائهم على قيد الحياة غير متأثر بعد 24 ساعة من التعدي. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر الفحص المجهري فائق الدقة توطين شبه نووي لمجمعات تعداء ذات 3 ألوان. يتم تأكيد سمية PEI من خلال تناقص وظائف الخلايا المنقولة miR / PEI.

الأهم من ذلك ، أن MNP يعيد خصائص الخلية. لا تختلف الخلايا المعدلة miR / PEI / MNP عن الخلايا غير المعالجة من حيث تكوين الأنبوب. علاوة على ذلك ، تحافظ هذه الخلايا على اتصال تقاطع الفجوة بين الخلايا كما تم الكشف عنه من خلال استعادة التألق بعد التبييض الضوئي.

بمجرد أن يتم زرع تعليق الخلايا المعدلة miR / PEI / MNP في آبار صفيحة الثقافة الموضوعة على شاكر الدوار ، تميل الخلايا إلى الهجرة والالتصاق في منطقة تطبيق المغناطيس المحلي. تصور الصور التمثيلية نمو الخلايا في المنطقة باستخدام تطبيق المغناطيس. بدون تطبيق المغناطيس.

وفي وسط بئر المزرعة حيث كان تدفق السائل يركز الخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تعداء الخلايا في غضون ساعتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك انطباع جيد جدا حول كيفية تعديل الخلايا البطانية بشكل عابر ولكن بكفاءة عالية بما في ذلك المغنطة.

وأيضا كيفية توصيف منتج الخلية بشكل نهائي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اتباع أرقام معينة لكميات بذر الخلايا من المكونات لإعداد مجمعات التعدي ، ووقت الحضانة ، وخطوة الغسيل بعد التعدي. نحن متفائلون جدا بأن هذا النهج سيكون قابلا للنقل إلى أنواع الخلايا الأخرى لعلاج الأعضاء المصابة الأخرى.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء دراسات في الجسم الحي مع الخلايا الممغنطة المعدلة. يمكنهم الإجابة على أسئلة إضافية حول ما إذا كان تحميل الخلايا بالحديد فعالا لضمان الاحتفاظ بها في جانب الاهتمام. وأيضا لتحديد حدود الكشف باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي.