تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير بروتين مأشوب من بكتيريا غير ممرضة لتسهيل الدراسات الكيميائية الفيزيائية الحيوية، مثل بلورات البروتين بالأشعة السينية أو الحركية الإنزيمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول كيفية تحضير البروتين المأشوب المطلوب باستخدام بكتيريا غير ممرضة من أجل التوصيف الفيزيائي الحيوي الأولي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية إجراء التوصيف الفيزيائي الحيوي للبروتين المطلوب في أي مختبر مجهز بالأجهزة الشائعة، مثل حاضنات المزارع الخلوية وأجهزة قياس الطيف الضوئي.

لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير تفاعل الربط كما هو موضح في البروتوكول النصي. انقل بواسطة الماصة 3 µL من تفاعل الربط المُحضّر إلى أنبوب يحتوي على 50 µL من خلايا E.coli DH5 alpha ذات الكفاءة الكيميائية. استخدم الماصة لمزج المحلول بلطف.

يُوضع المحلول على الثلج لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، تُجرى صدمة حرارية لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية. عقب ذلك، يُضاف 1 mL من وسط LB وتُنمى الخلايا مع الرج بقوة بسرعة 250 دورة في الدقيقة، عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

قم بنشر 100 µL من الخلايا المتحولة على طبق LB auger مضاف إليه 100 µg/mL من الكاناميسين. تُحضن الصفائح لمدة 18 ساعة عند 37 °C. باستخدام طرف ماصة معقم، قم بالتقاط المستعمرات من الطبق.

قم بتنمية الخلايا في 3 mL من وسط LB المكمل مع الرج القوي بمعدل 250 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 18 °C لمدة 18 ساعة. بعد ذلك، قم بتحضير DNA البلازميد وتأكيد التسلسل النيوكليوتيدي كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد إعادة تحويل سلالة E.coli BL21، اختر مستعمرة واحدة باستخدام طرف ماصة معقم وقم بتلقيح 10 mL من وسط LB الذي يحتوي على 150 µg/mL من الكاناميسين.

يُحضن المزيج عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع الرج القوي بسرعة 250 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، يتم نقل 10 milliliters من المزرعة الليلية إلى لتر واحد من وسط LB وkanamycin. تُنمى المزرعة عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 nanometers إلى 0.7.

بعد ذلك، اغمر المزرعة في ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. أضف IPTG إلى المزرعة، بحيث يكون التركيز النهائي 1 millimolar. قم بالتحضين عند درجة حرارة 18 °C لمدة إضافية تتراوح من 16 إلى 18 ساعة.

بعد ذلك، يتم إجراء الطرد المركزي عند 5,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. أزل السائل الطافي بعناية. أعد تعليق الخلايا في 50 µL من PBS يحتوي على 10 mM من imidazole.

بعد ذلك، قم بتحليل الخلايا مرتين على الثلج كما هو مفصل في البروتوكول النصي. قم بالطرد المركزي عند 25,000 ×g لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C لتصفية ناتج تحليل الخلايا. ثم، اخلط 3 mL من حبيبات النيكل و 47 mL من PBS المحتوي على 10 mM من الإيميدازول في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.

مرر المحلول المنظم الإضافي بتدفق الجاذبية لترسيب الخرز المتوازن في عمود كروماتوغرافيا زجاجي بمقاس 2.5 في 10 سنتيمتر. باستخدام الماصة، انقل الطافي إلى العمود. ثم قم بالتحضين عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعتين على عجلة دوارة بسرعة 20 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك، اترك السائل الطافي يتصرف بفعل الجاذبية. اغسل حبيبات النيكل ثلاث مرات باستخدام 100 milliliters من PBS المحتوي على 10 millimolar من imidazole لكل غسلة. ثم، أضف خمسة milliliters من PBS المحتوي على 250 millimolar من imidazole لاستخلاص بروتين RBC 1531.

قم بتحليل 15 µL من ناتج الاستخلاص عبر SDS Page كما هو موضح في البروتوكول النصي. انقل الأجزاء التي تم جمعها باستخدام الماصة إلى أنبوب دياليز. ضع الأنبوب في دورق يحتوي على أربعة لترات من المنظم المتوافق مع قطع الثرومبين عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل.

في اليوم التالي، استخدم ماصة لنقل الأجزاء إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter. قم بقياس الامتصاصية عند 280 nanometers لتقدير تركيز البروتين كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد ذلك، انقل 50 microliters من بروتين RBC 1531 إلى عدة أنابيب.

أضف كميات مختلفة من الثرومبين إلى كل أنبوب واحضنها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. وبعد تحديد أقل كمية مطلوبة من الثرومبين، أضف 10 milligrams من البروتين و 60 units من الثرومبين إلى أنبوب سعة 15 milliliter. ثم احضن الخليط عند درجة حرارة 20 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك، انقل البروتين المهضوم بواسطة الثرومبين إلى أنبوب ترشيح طرد مركزي. قم بإجراء الطرد المركزي عند 3,000 ×g في درجة حرارة 4 °C لتقليل الحجم إلى أقل من 5 mL. بعد ذلك، قم بتحميل البروتين المركز على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المُجهز.

قم بجمع 60 جزءاً من ناتج الشطف بمقدار 0.5 milliliters لكل أنبوب. يتم تشغيل 15 microliters من كل جزء على هلام 15%SDS Page كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، قم بدمج الأجزاء التي تحتوي على البروتين RBC 1531.

للبدء، انقل الأجزاء المجمعة إلى أنبوب ترشيح طرد مركزي. قم بإجراء الطرد المركزي عند 3,000 ×g في درجة حرارة 4 °C لتركيز البروتين إلى 18.5 mg/mL تقريبًا. بعد ذلك، أضف 50 µL من كل محلول فحص بلورة إلى آبار لوحة بلورة بنظام القطرة الجالسة ذات 96 بئراً.

أضف 0.5 microliters من محلول البروتين المركز على قاعدة التثبيت. اخلط محلول البروتين بشكل منفصل مع 0.5 microliters من محلول الفجوة. غطِّ اللوحة بفيلم لاصق شفاف.

يتم التحضين عند درجة حرارة 18 °C والسماح بحدوث انتشار البخار. باستخدام مجهر ضوئي، يتم فحص القطرات بتكبير يتراوح من 20 إلى 40 مرة لمراقبة تكون البلورات يومياً لمدة تتراوح من أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد تحضير ركائز NTP، يتم إضافة كل منها إلى لوحة ذات 96 بئراً.

أضف 20 µg من بروتين RBC 1531 إلى كل بئر باستخدام الماصة مع الخلط. غطِّ الطبق بغطائه واحضنه عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، انقل الطبق إلى حمام مائي عند 70 °C لمدة 15 دقيقة لإيقاف التفاعلات الحفزية التي يتوسطها RBC 1531.

بعد ذلك، أضف 1 µL من إنزيم S.cerevisiae inorganic pyrophosphatase إلى كل بئر. يتم التحضين عند 20 °C لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 16 µL من محلول حمض المولييدات إلى لوحة التفاعل لتطوير اللون.

بعد مرور 15 دقيقة، قم بقراءة الكثافة الضوئية عند 690 nanometers. وفي هذه الدراسة، يتم توصيف المنتج البروتيني لجين BC1531 من السلسلة B على المستوى الجزيئي. وبعد التنقية باستخدام كروماتوغرافيا الألفة للنيكل، يتم إجراء تجربة هضم بالثرومبين.

تبيّن أن 0.3 units من thrombin هي أقل كمية مطلوبة لإزالة وسم الألفة (affinity tag) تماماً من RBC 1531. وبعد عملية الهضم، يتم تنقية البروتين الخالي من الوسم لتصل نقاوته إلى 99% تقريباً، وذلك باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (size exclusion chromatography). بعد ذلك، يتم تقدير الحالة الأوليغومرية (oligomeric status) بواسطة كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي.

بما أن RBC 1531 يتم شطفه عند 84 milliliters تقريبًا، فإن وزنه الجزيئي يُقدّر بـ 55 kilodaltons. ويبلغ الوزن الجزيئي المحسوب للمونومر حوالي 13 kilodaltons. وبناءً على ذلك، يتجمع RBC 1531 على هيئة رباعي القسيمات (tetramer).

بعد ذلك، يتم إجراء فحص البلورة باستخدام طريقة انتشار البخار بقطرة جالسَة. تظهر البلورات بعد يومين مع استخدام 1 molar sodium citrate و 20%polyethylene glycol 3, 000، ومع 0.1 molars sodium cacodylate و 1 molar sodium citrate. بعد ذلك، يتم تحديد نشاط NTPase.

لا يُلاحظ أي تغير لوني مرئي بعد إضافة الموليبدات إلى تفاعل التحلل المائي بوساطة RBC 1531. ومع ذلك، عند إضافة بيروفوسفاتاز، يُلاحظ تغير اللون إلى الأزرق الداكن. بعد ذلك، يتم تحليل الكثافة الضوئية عند 690 nanometers وتركيز NTP باستخدام الانحدار غير الخطي.

تم تحديد أن إنزيم RBC 1531 يمتلك سرعة قصوى تبلغ 0.75 وثابت ميكايليس يبلغ 10 micromolar. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحضير عينات البروتين دون تأخير والتخلص من الأجزاء التي تحتوي على أي شوائب قد تعيق تبلور البروتين أو تسبب أخطاءً في المقايسات الإنزيمية. وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال علم الإنزيمات وعلوم البروتينات الأخرى لتوصيف البروتينات محل الاهتمام باستخدام أجهزة القياس الطيفي المتوفرة في معظم المختبرات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول الأفكار العامة لتحضير البروتينات المؤتلفة، وفحوصات البلورة، والحركية الإنزيمية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على التحليل الكيميائي الفيزيائي الحيوي لبروتينات أخرى تهمنا. لا تنسَ توخي الحذر عند التعامل مع البروتينات لأنها قد تكون غير مستقرة للغاية. ويُفضل اتخاذ احتياطات مثل ترك العينات فوق الثلج والتبريد عند 80 درجة للتخزين طويل الأمد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير بروتين معاد التركيب من بكتيريا غير ممرضة للحصول على بلورات بروتينية من أجل تحديد البنية بواسطة علم البلورات بالأشعة السينية، وكيفية توصيف النشاط الإنزيمي باستخدام طريقة قياس الألوان.