تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل العصوية -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير بروتين مؤتلف من البكتيريا غير المسببة للأمراض لتسهيل الدراسات الكيميائية الفيزيائية الحيوية مثل علم البلورات بالأشعة السينية للبروتين أو الحركية الأنزيمية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في كيفية تحضير البروتين المؤتلف ذي الأهمية باستخدام البكتيريا غير المسببة للأمراض للتوصيف الفيزيائي الحيوي الأولي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التوصيف الفيزيائي الحيوي للبروتين ذي الأهمية يمكن إجراؤه في أي مختبر مجهز بأدوات شائعة مثل حاضنات زراعة الخلايا ومقاييس الطيف الضوئي.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد تفاعل الربط كما هو موضح في بروتوكول النص. ماصة ثلاثة ميكرولترات من تفاعل الربط المحضر في أنبوب يحتوي على 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية DH5 ألفا المختصة كيميائيا. باستخدام ماصة ، امزج المحلول برفق.

ضع الثلج على المحلول لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، صدمة حرارية لمدة 45 ثانية عند 42 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من وسط LB وقم بتنمية الخلايا أثناء الاهتزاز بقوة عند 250 دورة في الدقيقة ، عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.

انشر 100 ميكرولتر من الخلايا المحولة على صفيحة مثقاب LB مكملة ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر كاناميسين. احتضن لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. باستخدام طرف معقم ، اختر المستعمرات من اللوحة.

قم بزراعة الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط LB المكمل مع الاهتزاز القوي عند 250 دورة في الدقيقة عند 18 درجة مئوية لمدة 18 ساعة. بعد ذلك ، قم بإعداد الحمض النووي للبلازما وتأكيد تسلسل النيوكليوتيدات كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد إعادة تحويل سلالة الإشريكية القولونية BL21 ، حدد مستعمرة باستخدام طرف معقم وقم بتلقيح 10 مل من وسط LB الذي يحتوي على 150 ميكروغرام لكل مليلتر من الكاناميسين.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة مع اهتزاز قوي بمعدل 250 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، انقل 10 ملليلتر من المزرعة الليلية إلى لتر واحد من LB ووسط الكاناميسين. تنمو عند 37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر إلى 0.7.

ثم اغمر المزرعة في ماء مثلج لمدة 15 دقيقة. أضف IPTG إلى المزرعة ، بحيث يكون التركيز النهائي ملليموليا واحدا. احتضن عند 18 درجة مئوية لمدة 16 إلى 18 ساعة إضافية.

بعد ذلك ، جهاز الطرد المركزي عند 5 ، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من PBS تحتوي على 10 مللي مولار إيميدازول.

بعد ذلك ، قم بتحليل الخلايا مرتين على الجليد كما هو مفصل في بروتوكول النص. جهاز طرد مركزي عند 25 ، 000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية لمسح محللة الخلية. بعد ذلك ، اخلطي ثلاثة ملليلتر من حبات النيكل و 47 مل من PBS تحتوي على 10 ملليمولار إيميدازول في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

تتدفق الجاذبية المخزن المؤقت الإضافي لتسوية الخرزات المتوازنة في عمود كروماتوغرافيا زجاجي 2.5 × 10 سم. باستخدام ماصة ، انقل المادة الطافية إلى العمود. احتضن عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على عجلة دوارة بمعدل 20 دورة في الدقيقة.

بعد ذلك ، اسمح للطافي بالتصريف عن طريق الجاذبية. اغسل حبات النيكل ثلاث مرات باستخدام 100 مل PBS تحتوي على 10 مللي مولار إيميدازول لكل غسلة. بعد ذلك ، ضع خمسة ملليلتر من PBS الذي يحتوي على 250 مللي مولار إيميدازول لتصفية بروتين RBC 1531.

قم بتحليل 15 ميكرولترا من الشطف عبر صفحة SDS كما هو موضح في بروتوكول النص. ماصة الكسور المجمعة في أنبوب غسيل الكلى. ضع الأنبوب في دورق يحتوي على أربعة لترات من المخزن المؤقت المتوافق مع انقسام الثرومبين عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في اليوم التالي ، استخدم ماصة لنقل الكسور إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر لتقدير تركيز البروتين كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، انقل 50 ميكرولترا من بروتين RBC 1531 إلى عدة أنابيب.

أضف كمية مختلفة من الثرومبين إلى كل أنبوب واحتضنه عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد تحديد أقل كمية من الثرومبين المطلوبة ، أضف 10 ملليغرام من البروتين و 60 وحدة من الثرومبين إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. احتضان عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك ، انقل البروتين المهضوم الثرومبين إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 مرة G عند أربع درجات مئوية لتقليل الحجم إلى أقل من خمسة ملليلتر. بعد ذلك ، قم بتطبيق البروتين المركز على عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المجهز.

اجمع 60 كسرا مطربا مع 0.5 مل لكل أنبوب. قم بتشغيل 15 ميكرولترا من كل كسر على هلام صفحة SDS بنسبة 15٪ كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم اجمع الكسور التي تحتوي على بروتين RBC 1531.

للبدء في نقل الكسور المجمعة إلى أنبوب مرشح الطرد المركزي. جهاز طرد مركزي عند 3 ، 000 مرة جم عند أربع درجات مئوية لتركيز البروتين إلى حوالي 18.5 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من كل محلول فحص تبلور إلى آبار لوحة تبلور قطرة 96 بئر.

أضف 0.5 ميكرولتر من محلول البروتين المركز على سرير الجلوس. امزج محلول البروتين بشكل منفصل مع 0.5 ميكرولتر من محلول البئر. قم بتغطية اللوحة بغشاء لاصق شفاف.

احتضان عند 18 درجة مئوية والسماح بانتشار البخار. باستخدام المجهر الضوئي ، امسح القطرات عند تكبير 20 إلى 40 مرة لمراقبة تكوين البلورات يوميا لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. بعد تحضير ركائز NTP ، أضف كل منها إلى لوحة 96 بئر.

أضف 20 ميكروغراما من بروتين RBC 1531 إلى كل بئر باستخدام ماصة للخلط. غطي الطبق بغطاءه واحتضنه على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، انقل اللوحة إلى حمام مائي 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإيقاف التفاعلات التحفيزية بوساطة RBC 1531.

بعد ذلك ، أضف ميكرولتر واحد من S.cerevisiae بيروفوسفاتيز غير العضوي إلى كل بئر. احتضن عند 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 16 ميكرولترا من محلول حمض الموليبدات إلى لوحة التفاعل لتطوير اللون.

بعد 15 دقيقة ، اقرأ الكثافة الضوئية عند 690 نانومتر. في هذه الدراسة ، يتميز منتج البروتين لجين B الخطير BC1531 على المستوى الجزيئي. بعد التنقية بواسطة كروماتوغرافيا تقارب النيكل ، يتم إجراء مسار هضم الثرومبين.

ينظر إلى 0.3 وحدة من الثرومبين على أنها أقل كمية مطلوبة لإزالة علامة التقارب تماما من RBC 1531. بعد الهضم ، يتم تنقية البروتين الخالي من العلامات إلى نقاء 99٪ تقريبا ، باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. بعد ذلك ، يتم تقدير حالة القلة من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم.

نظرا لأن RBC 1531 يتم تخفيضه بحوالي 84 مليلترا ، يقدر وزنه الجزيئي ب 55 كيلو دالتون. يبلغ الوزن الجزيئي المحسوب للمونومر حوالي 13 كيلودالتون. لذلك ، يتجمع RBC 1531 كراعي

ثم يتم إجراء فحص التبلور باستخدام طريقة نشر بخار قطرة الجلوس. تظهر البلورات بعد يومين مع سترات الصوديوم المولية و 20٪ بولي إيثيلين جلايكول 3 ، 000 ، ومع 0.1 أضراس كاكوديلات الصوديوم وسيترات الصوديوم المولارية. بعد هذا يتم تحديد نشاط NTPase.

لا يظهر أي تغيير مرئي في اللون بعد إضافة الموليبدات إلى تفاعل التحلل المائي بوساطة RBC 1531. ومع ذلك ، عند إضافة البيروفوسفاتيز ، ينظر إلى اللون على أنه يتغير إلى اللون الأزرق الغامق. ثم يتم تحليل الكثافة البصرية عند 690 نانومتر وتركيز NTP باستخدام الانحدار غير الخطي.

تم تحديد إنزيم RBC 1531 ليكون له سرعة قصوى عند 0.75 وثابت ميكايليس يبلغ 10 ميكرومولار. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحضير عينات البروتينات دون تأخير والتخلص من الكسور التي تحتوي على أي شوائب تعيق تبلور البروتين أو تسبب أخطاء في المقايسات الأنزيمية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأنزيمات وعلوم البروتين الأخرى لتوصيف البروتينات ذات الأهمية باستخدام مقاييس الطيف الضوئي المزينة في معظم المختبرات.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأفكار العامة لإعداد البروتين المؤتلف ، وشاشات التبلور ، والحركية الأنزيمية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التحليل الكيميائي الفيزيائي الحيوي للبروتينات الأخرى التي تهمنا. لا تنس توخي الحذر عند العمل مع البروتينات لأنها يمكن أن تكون غير مستقرة للغاية. ستكون الاحتياطات المطلوبة مثل ترك العينات فوق الجليد والتبريد عند 80 درجة للتخزين طويل الأجل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير البروتين المؤتلف من البكتيريا غير المسببة للأمراض للحصول على بلورات البروتين لتحديد الهيكل عن طريق علم البلورات بالأشعة السينية وكيفية توصيف النشاط الأنزيمي باستخدام طريقة قياس الألوان.